Úloha Streptococcus mutans v orálnom biofilme

Souhrn

Streptococcus mutans patrí medzi primárnych kolonizátorov ústnej dutiny. Vďaka vhodným virulenčným faktorom – produkcia glukánov, rezistencia voči kyselinám, prirodzená kompetencia a tvorba kompaktného biofilmu, má istú výhodu oproti iným primárnym kolonizátorom. Je považovaný za hlavný etiologický agens zubného kazu. V súčasnosti je zubný kaz považovaný za fenomén súvisiaci s metabolickou aktivitou baktérií v orálnom biofilme a má významný nielen zdravotný, ale aj socioekonomický dopad.

Klíčová slova:
Streptococcus mutans – zubný kaz – glukány

VŠEOBECNÁ CHARAKTERISTIKA ORÁLNEHO BIOFILMU

Človek je počas svojho života kolonizovaný rôznymi mikroorganizmami [1], ktoré významne ovplyvňujú jeho fyziologický status [2, 3]. Ústna dutina predstavuje vhodné prostredie pre rast mikroorganizmov vďaka vlhkosti, optimálnej teplote (35–36 °C), vhodnému pH (6,75–7,25) a dostatočnému prísunu živín [4, 5]. Orálne mikroorganizmy tvoria v ústnej dutine (zubná sklovina, ďasná, jazyk) plak odborne nazývaný aj orálny biofilm [6]. Je to funkčne a štrukturálne organizované spoločenstvo mikroorganizmov, obklopené extracelulárnym matrixom zloženým z exopolymérov a DNA, ktoré je prirodzenou súčasťou ústnej dutiny u zdravých jedincov, pričom poskytuje hostiteľovi výhody (ochrana pred patogénnymi mikroorganizmami) [7, 8, 9, 10]. Ak dôjde k narušeniu prirodzenej homeostázy medzi hostiteľom a mikroorganizmami, objavujú sa infekcie, ktoré môžu spôsobiť až zubný kaz či parodontitídu [11]. Vo všeobecnosti je tvorba biofilmu pre mikroorganizmy výhodná z hľadiska ich prežitia. Matrix, ktorý ich obklopuje, im poskytuje ochranu voči toxickým látkam, UV žiareniu, antimikrobiálnym látkam, mechanickému poškodeniu alebo bakteriofágom, či imunitnej odpovedi hostiteľa [12]. Formovanie biofilmu prebieha v šiestich základných štádiách – prvou fázou je prisadnutie planktonických buniek na biotický alebo abiotický povrch pomocou adhezínov. Tento proces je reverzibilný. Prichytené bunky sa množia a produkujú makromolekuly, čím k sebe navzájom priľnú a vytvoria sa tak mikrokolónie. Rastom mikrokolónií dochádza k vylučovaniu polysacharidov, proteínov, lipidov a uvoľňovaniu DNA. Tvorí sa tak matrix obaľujúci bunky a biofilm dozrieva – maturuje. Vplyvom rôznych faktorov dochádza k heterogénnemu usporiadaniu buniek a molekúl v biofilme a k vzniku kanálov a dutiniek. Tie slúžia na prísun živín do hlbších štruktúr biofilmu. V prípade nepriaznivých podmienok (napr. vyčerpanie živín, nedostatok miesta) sa z biofilmu uvoľňujú disperzné bunky, ktoré pri vhodných podmienkach adherujú a vytvárajú nový biofilm, na inom mieste (obr. 1) [13, 14, 15].

Ústna dutina, rovnako ako iné biotopy v tele človeka, je kolonizovaná charakteristickou a komplexnou mikroflórou, ktorá je zložená z prvokov, kvasiniek, mykoplaziem, Archaea a eubaktérií. Iba asi polovica z týchto mikroorganizmov je kultivovateľná. Pomocou rôznych postupov, nezávislých od kultivácie, sa doposiaľ podarilo identifikovať 1 200 taxónov. Pritom v ústnej dutine jednotlivca je možné identifikovať len približne 100 druhov z tohto počtu [16, 17, 18]. Zloženie ústnej mikroflóry sa mení v závislosti od povrchu, napríklad na mukóznom povrchu sliznice je veľmi nízke zastúpenie mikroorganizmov. Dôvodom je neustále odlupovanie sa vrchnej časti buniek, tzv. deskvamácia. Naproti tomu je na zubnom povrchu najvyššie zastúpenie mikrobiálnej biomasy v rámci ústnej dutiny. V zárezoch žuvacích plôch molárov sa vyskytujú najmä aeróbne a fakultatívne anaeróbne, sacharolytické, Gram-pozitívne baktérie, prevažne streptokoky a len veľmi nízky počet anaeróbnych alebo Gram-negatívnych baktérií. V gingiválnom vačku sú v prevahe proteolytické, obligátne anaeróbne Gram-negatívne baktérie. Sliny obsahujú 10⁸ mikroorganizmov/ml, ktoré pochádzajú z rôznych častí ústnej dutiny, najmä jazyka [19]. Orálna mikroflóra je pre hostiteľa prirodzená a v čase relatívne nemenná. Narušením homeostázy dochádza k vzniku infekčných ochorení. Pomnožením acidorezistentných a acidotolerantných druhov baktérií, ako sú streptokoky, laktobacily alebo bifidobaktérie, dochádza k tvorbe zubného kazu. Na prepuknutí parodontitídy sa podieľajú proteolytické baktérie, ako sú obligátne anaeróbne Gram-negatívne druhy z rodov Prevotella, Porphyromonas, Fusobacterium, Treponema, Tannerella a niektoré nekultivovateľné druhy, vyvolávajúce zápal [11, 19].

Pri vývoji orálneho biofilmu zohrávajú dôležitú úlohu molekuly bakteriálneho pôvodu (lipoteichoové kyseliny, extracelulárne polysacharidy syntetizované glukozyltransferázami a fruktozyltransferázami) a molekuly pochádzajúce zo slín hostiteľa (proteíny bohaté na prolín, amylázu, histatín, lyzozým, peroxidázu, mucín), ktoré tvoria film označovaný ako pelikula. Na pelikulu sa spočiatku reverzibilne viažu kolonizujúce mikroorganizmy cez slabé fyzikálno-chemické väzby medzi nabitými chemickými skupinami v povrchových štruktúrach mikroorganizmov. Táto väzba sa môže stať permanentnou prostredníctvom interakcií medzi bakteriálnymi adhezínmi a komplementárnymi väzobnými miestami na pelikule. Prvotnými kolonizátormi ústnej dutiny sú najmä streptokoky (tvoria až 80 % z celkového počtu mikroorganizmov, ktoré sa podieľajú na prvotnej kolonizácii ústnej dutiny), v menšej miere baktérie rodu Actinomyces, Capnocytophaga, Eikenella, Haemophilus, Prevotella, Propionibacterium a Veillonella. Ich hlavnou úlohou pri formovaní biofilmu je produkcia rôznych typov adhezínov (antigén I/II, PaG, SspA, amylázu viažúce proteíny a iné), ktoré slúžia na naviazanie sa na väzobné miesta na pelikule hostiteľa a ako receptory pre naviazanie sa sekundárnych kolonizátorov (koadhézia), čím sa zvyšuje rozmanitosť a formuje sa viacdruhový biofilm [20]. Prisadnuté baktérie syntetizujú rôzne extracelulárne polyméry a formujú matrix biofilmu, ktorý je, vďaka svojej schopnosti viazať a zachovávať si rôzne molekuly (napr. enzýmy), biologicky veľmi aktívny [21, 22, 23].

V ústnej dutine sa rozlišujú dva typy biofilmu, ktoré sa líšia miestom výskytu (subgingiválny a supragingiválny) a mikrobiálnym zložením. Supragingiválny plak je zložený z aktinomycét, streptokokov, laktobacilov a kandíd, ktoré vytvárajú prvú vrstvu. Počas maturácie biofilmu dochádza k agregácii a rastu iných druhov baktérií, pričom po siedmych dňoch dochádza k zníženiu počtu streptokokov a zvýšeniu počtu baktérií Fusobacterium nucleatum. Po troch týždňoch sa supragingiválny plak začína morfologicky podobať subgingiválnemu plaku. Ten sa skladá zo štyroch vrstiev, pričom prvú vrstvu tvoria bunky aktinomycét. V druhej vrstve subgingiválneho plaku sú prítomné baktérie vretenovitého tvaru – F. nucleatum a Tannerella sp. Tretia a štvrtá vrstva biofilmu pozostáva najmä z klastrov baktérií z taxónov Cytophaga--Flavobacterium-Bacteroides a Tannerella, Prevotella a Bacteroidetes [11, 24, 25].

Komunikácia medzi jednotlivým druhmi mikroorganizmov v orálnom biofilme je sprostredkovaná pomocou quorum sensing (QS) mechanizmu. Týmto termínom sa označuje schopnosť mikroorganizmov v biofilme vylučovať a detegovať molekuly autoinduktorov, ktoré sa v biofilme hromadia v priamej závislosti od zvyšujúcej sa hustoty buniek [20, 21, 24, 25]. Ak hladina autoinduktorov dosiahne tzv. prahovú hodnotu („threshold level“), aktivujú sa receptory, ktoré pomocou kaskády prenosu signálu zapnú gény, ktoré sú v bakteriálnych bunkách zodpovedné za koordináciu mikrobiálnej populácie [26]. QS mechanizmus je zodpovedný za riadenie takých procesov v biofilme, ako je adherencia buniek na povrchy, tvorba spór, kompetencia buniek, bioluminiscencia alebo expresia virulenčných faktorov. Ide o vysoko špecifický a presný proces riadenia [27, 28]. Autoinduktory sú malé molekuly, ktoré sú buď schopné voľne prechádzať cez bunkové membrány, alebo sú aktívne transportované z buniek pomocou ABC transportérov, prípadne väzbou na membránovo-viazanú senzor-kinázu. Niektoré autoinduktory sú do buniek transportované pomocou oligopeptidových permeáz, ktoré následne interagujú s intracelulárnymi receptormi [29, 30].

Pri Gram-pozitívnych baktériách pozostávajú QS systémy z troch zložiek – signálneho peptidu a dvojzložkového regulačného systému TCSTC (Two-Component Signal Transduction System). TCSTC je zložený z membránovo viazanej histidín-kinázy (HK) a regulátora zodpovedného za medzibunkovú odpoveď (RR – Intracellular Response Regulator) [31]. Pri S. mutans je QS mechanizmom regulovaná ich schopnosť prirodzene prijímať cudzorodú DNA – prirodzená kompetencia, regulácia tolerancie na prítomnosť kyslých produktov v prostredí (ATR – Acid Tolerance Response) a schopnosť tvoriť biofilm [32]. Za spustenie génovej kompetencie sú pri S. mutans zodpovedné produkty aspoň piatich génov – comAB a comCDE. Gény comC, comD a comE kódujú prekurzory pre kompetenciu stimulujúci peptid (CSP – Competence Stimulating Peptid) – HK a RR [33]. Tieto gény sú kódované na chromozóme tesne vedľa seba, zatiaľ čo ostatné dva gény comA a comB sú lokalizované na inej časti chromozómu a kódujú ABC transportér (comA) a prídavný proteín (comB), ktoré sú zodpovedné za sekréciu CSP [34]. Zistilo sa, že okrem týchto piatich génov ovplyvňuje kompetenciu S. mutans aj gén comX. Je homológom alternatívneho sigma faktora, ktorý bol nájdený pri Streptococcus pneumoniae a riadi transkripciu RNA polymeráz, ktoré sa podieľajú na prepise génov riadiacich kompetenciu [35]. Bolo zistené, že rovnaké gény, ktoré sa podieľajú na prirodzenej kompetencii S. mutans (comCDE) ovplyvňujú aj tvorbu biofilmu a ATR, pričom ich expresia závisí od hustoty buniek v prostredí [36, 37].

PODIEL STREPTOKOKOV NA VZNIKU ZUBNÉHO KAZU

Zubný kaz je stav, kedy dochádza k poškodeniu skloviny, prípadne aj zuboviny. Je to jeden z najčastejšie sa vyskytujúcich problémov súčasnej medicíny, ktorý má aj významný socio-ekonomický dopad. Hoci sa vyskytoval už v staroveku, považuje sa za medicínsky problém modernej doby. V Európe bol masovo rozšírený v 19. storočí. Pokles nastal v 40.–60. rokoch 20. storočia, kedy sa v Európe začalo s fluorizáciou vody a v neskoršom období aj zubných pást [38, 39, 40]. Zubný kaz vzniká v dôsledku premeny cukrov, prijímaných v potrave, na kyseliny, ktoré rozrušujú zubnú sklovinu a dentín. K tejto premene dochádza pôsobením baktérií orálneho biofilmu. Zistilo sa, že proces rozrušovania zubnej skloviny a dentínu nie je kontinuálny, ale cyklický. Fáza demineralizácie sa strieda s fázou remineralizácie zubnej skloviny, pričom k vytvoreniu zubného kazu dôjde len v prípade masívnejšej demineralizácie. K remineralizácii skloviny a dentínu prispievajú najmä sliny, obsahujúce vápnik a čistenie zubov zubnými pastami obsahujúcimi fluorid [40]. Dôležitou súčasťou prevencie vzniku zubného kazu je správna životospráva. Výsledky dvoch experimentov [41,42] na potkanoch dokázali, že na vzniku zubného kazu sa podieľa prirodzená ústna mikroflóra ako aj prítomnosť cukrov v ústnej dutine, prijímaných v potrave. Dôležitým zistením [43] bol aj fakt, že k narušeniu zubnej skloviny dochádza pri poklese pH pod 5,5. V tejto štúdii sa zistilo, že pH v ústnej dutine rýchlo klesá z pH 7 na pH 5,5 a nižšie po prijatí cukrov, pričom čas potrebný na jeho úpravu na pôvodnú hodnotu je 40 minút. Za nárast pH na pôvodnú hodnotu sú zodpovedné sliny, ktoré neutralizujú kyseliny a odmývajú zvyšky potravy zo zubného povrchu a slizníc. Okrem týchto experimentov bolo vykonaných niekoľko ďalších [44, 45], ktoré zhodne potvrdili kariogénny (podieľajúci sa na vzniku zubného kazu) účinok cukrov (sacharózy, maltózy, fruktózy a glukózy). Zo spomenutých prác tiež vyplýva, že na vznik zubného kazu má vplyv množstvo a frekvencia prijímania cukrov v potrave, pričom tento vzťah je priamo úmerný závažnosti rozvoja zubného kazu. Je potrebné rozlišovať zdroje prijímaných sacharidov, keďže niektoré potraviny ich obsahujú prirodzene – mlieko (laktóza), ovocie, zelenina. Zistilo sa, že z celkovej dennej dávky prijatých cukrov (118 g) dve tretiny pochádzajú z potravín s umelo dodávaným cukrom, najmä sladkých nealkoholických nápojov [46].

Vyvinutých bolo niekoľko stratégií prevencie zubného kazu založených či už na obrane hostiteľa, alebo oslabení patogéna. Do prvej skupiny patria:

1. zníženie rozpustnosti zubnej skloviny pôsobením kyselín,
2. zvýšenie schopnosti remineralizácie,
3. pokrytie zubnej skloviny látkou, ktorá by vytvárala ochranu pred prichytávaním sa biofilmu. Druhá skupina zahŕňa:
• mechanické odstránenie zubného biofilmu,
• zmenu genetickej výbavy baktérií tak, aby sa znížila ich schopnosť metabolizovať cukry na kyslé produkty a 
• zníženie príjmu cukrov v potrave [47, 48].

Najbežnejším spoločenským návykom prevencie zubného plaku a vzniku zubného kazu je umývanie zubov. V prípade vhodnej techniky je tento spôsob odstraňovania orálneho biofilmu dostatočne efektívny, pričom na znížení vzniku zubného kazu sa vo veľkej miere podieľa práve fluorid prítomný v zubných pastách [49].

Petersen et al. [50] zistili, že výskyt zubného kazu rastie aj s pribúdajúcim vekom, pričom ľudia vo veku 65 rokov majú 22 zubov (z 32) pokazených, s výplňou alebo im chýbajú. Ošetrenie zubného kazu je pomerne finančne nákladné, čím sa stáva nedostupným najmä pre znevýhodnené a chudobné obyvateľstvo (výdavky na ošetrenie zubného kazu v roku 2011 v rámci 27 členských štátov Európskej únie dosiahli 79 biliónov €) [48].

Nedostatočná ústna hygiena môže viesť k tvorbe zubného kazu a jeho zanedbanie môže mať výrazne negatívny vplyv na kvalitu života. Dôsledky spojené so zanedbaním ošetrenia zubného kazu majú výrazný vplyv najmä na deti a adolescentov [51, 52]. Neošetrenie zubného kazu spôsobuje mierne až silné bolesti, zubné sepsy [53, 54], ťažkosti pri žuvaní; sekundárnymi problémami potom môžu byť ťažkosti s učením (nesústredenosť) [55], poruchy spánku a chovania[56], znížený príjem potravy, čo vedie k strate hmotnosti a podvýžive, čím sa celkovo naruší obranyschopnosť organizmu [57].

Zástupcovia rodu Streptococcus sú súčasťou prirodzenej ľudskej mikroflóry a najčastejšie sú izolovaní z ústnej dutiny, gastrointestinálneho a urogenitálneho traktu [58]. Skupina mutans streptokokov zahŕňa druhy – S. ­mutans, S. sobrinus, S. ratti, S. criceti, S. downei a S. ferus [59, 60, 61] a je vo všeobecnosti považovaná za významného pôvodcu zubného kazu.

V súčasnosti rod Streptococcus zahŕňa 99 druhov. Väčšina z týchto druhov je asociovaná z ochoreniami ľudí a zvierat [62]. Viridujúce streptokoky sa radia do štyroch fylogenetických klastrov – mitis, mutans, salivarius a anginosus. Zriedkavo môžu tieto mikroorganizmy vyvolať aj bakterémie, abscesy a infekčné endokarditídy [63, 64, 65, 66]. Mnohé kmene z tejto skupiny sú prirodzene geneticky kompetentné. Táto schopnosť horizontálneho génového prenosu im poskytuje selektívnu výhodu nad inými mikroorganizmami vďaka lepšej adaptácii na prostredie hostiteľa a vyhýbaniu sa jeho imunitnej odpovedi [67, 68]. Táto genetická diverzita zabezpečuje rôznorodosť jednotlivých izolátov. Streptococcus mutans je Gram-pozitívna, fakultatívne anaeróbna baktéria, ktorá sa vo voľnej prírode nevyskytuje a jej prirodzeným biotopom je ústna dutina. Patrí medzi prvých kolonizátorov na zubnom povrchu. V súčasnosti je považovaná za hlavný etiologický agens zubného kazu [69, 70]. Jej izolácia z ústnej dutiny u zdravých jedincov naznačuje, že prostredie v ústnej dutine zohráva dôležitú úlohu pri aktivácii faktorov virulencie tohto mikroorganizmu. Nadmerným rozmnožovaním S. mutans dochádza k zmene environmentálnych podmienok v ústnej dutine – klesá pH v dôsledku schopnosti premieňať cukry (sacharóza, škrob, glukóza) prijaté v strave na kyslé produkty, čo mu v konečnom dôsledku umožňuje lepšie prichytenie sa na povrch zubnej skloviny prostredníctvom extracelulárnych polysacharidov (EPS) – glukánov. Poklesom pH dochádza k demineralizácii zubnej skloviny, čo môže viesť k vzniku zubného kazu [71, 72]. Glukány sú syntetizované rôznymi povrchovo viazanými glukozyltransferázami (GTF) a tvoria hlavnú zložku orálneho biofilmu. Pri S. mutans boli doposiaľ identifikované tri typy glukozyltransferázových enzýmov (glukozyltransferáza typu B, C a D), z ktorých každý sa podieľa na syntéze štrukturálne odlišného typu glukánov [69]. GtfB (oficiálne GtfI) primárne syntetizuje nerozpustný glukán bohatý na α-1,3-glykozidové väzby. Tento typ glukánu slúži na naviazanie S. mutans na iné mikroorganizmy v orálnom biofilme (Candida albicans, Lactobacillus casei, Actinomyces viscosus) a je zodpovedný za tvorbu štrukturálne pevného a kohézneho matrixu biofilmu. Enzým je kódovaný génom gtfB, s veľkosťou 4,4 kbp a je súčasťou gtfBC operónu (obr. 2) [73, 74, 75]. Súčasťou tohto lokusu je aj gén gtfC, kódujúci glukozyltransferázu typu C (GtfSI), ktorého veľkosť je 4,3 kbp. GtfC syntetizuje zmes rozpustného (α-1,6-glykozidová väzba) a nerozpustného glukánu (α-1,3-glykozidová väzba), ktorých úlohou je väzba S. mutans na orálne povrchy pri kolonizácii [76]. Enzýmy gtfB a gtfC sú vysoko homologické (75 % identita aminokyselín) a ako už bolo spomínané, tvoria súčasť gtfBC operónu. Gény, ktoré ich kódujú sú od seba vzdialené 198 bp a predpokladá sa, že sú prepisované oproti sebe a môžu podliehať rovnakému regulačnému mechanizmu. Stále ostáva otázne, či zdieľajú spoločný promótor, alebo ide o dva osobitné promótory, ktoré sú koordinovane exprimované [69]. Gén gtfD (obr. 2) je lokalizovaný pred lokusom gtfBC a je regulovaný vlastným promótorom [77]. Gény kódujúce glukozyltransferázy B a C sú exprimované pri acidifikácii alebo pri nadbytku glukózy a sacharózy v prostredí [78, 79]. Transkripcia a translácia génu gtfD je zvýšená za prítomnosti iónov medi v prostredí [80]. Každý z GTF enzýmov má na amino-terminálnom konci signálny peptid zložený z približne 38 aminokyselín. Tento signálny peptid susedí s vysoko variabilnou doménou pozostávajúcou asi z 20 aminokyselín, ktoré sú charakteristické pre konkrétny enzým [81]. Na C terminálnom konci je prítomná sekvencia pozostávajúca zo série opakujúcich sa motívov aminokyselín. Táto sekvencia je odlišná pre GtfB a GtfC, čo môže čiastočne vysvetľovať preferencie v adsorbovaní enzýmov na orálne (GtfC) alebo ­mikrobiál­ne povrchy (GtfB). Enzýmy GtfB a GtfD majú podobnú hydrofilnú štruktúru. Enzým GtfC je taktiež hydrofilný, avšak na C terminálnom konci má hydrofóbnu doménu. Tá môže byť spojená s aktivitou enzýmu na orálnych povrchoch. Predpokladá sa, že táto aktivita je sprostredkovaná cez interakcie so špecifickými makromolekulami prítomnými v slinách, ako sú lyzozým a α-amyláza [69, 82]. Na expresiu génov kódujúcich glukozyltransferázy majú vplyv rôzne pozitívne a negatívne regulátory. Medzi nimi aj regulátor katabolickej expresie RegM, Clp systém zodpovedný za toleranciu na stres alebo dvojzložkové systémy VicRK a CovR, ktoré sú zodpovedné za riadenie virulencie pri S. mutans [82, 83]. RegM proteín reguluje katabolickú expresiu pri S. mutans a Staphylococcus sp. Jeho regulačná funkcia je založená na inhibícii génov, ktoré participujú na využití alternatívnych zdrojov uhlíka a na aktivácii expresie génov, ktorých produkty sa podieľajú na odstránení nadbytku uhlíka z buniek. Inaktivácia proteínu RegM má za následok nadmerný pokles expresie gtfBC promótora [84]. Pre organizmy, ktoré musia konštantne odolávať rôznym zmenám vonkajšieho prostredia, je dôležité udržanie bunkovej homeostázy. Na tomto procese sa podieľajú proteázy a s nimi asociované chaperóny. Ich úlohou je degradácia a recyklácia skrátených, poškodených alebo inak nefunkčných proteínov. Okrem toho systém proteáz priamo reguluje fyziologický stav buniek kontrolou hladiny špecifických proteínov, ktoré sa podieľajú na základných bunkových procesoch ako transkripcia, replikácia DNA alebo delenie buniek [85, 86]. Clp proteolytický systém je jedným z hlavných mechanizmov, ktorý sa na tejto rovnováhe podieľa. Ide o dvojzložkový systém zložený z ATPázovej a proteolytickej domény, ktoré sú kódované na dvoch samostatných peptidoch. Clp proteolytický (obr. 3) systém pri S. mutans pozostáva z ClpP proteolytickej podjednotky, ktorá je asociovaná z jednou z troch ATPáz (ClpC, ClpE, ClpX) [87, 88]. S. mutans kóduje okrem vyššie spomínaných aj ClpB a ClpL ATPázy, avšak tieto netvoria komplex s proteolytickou podjednotkou ale plnia úlohu samostatných chaperónov [87, 89]. Kmene s deléciou clpP génu vykazujú oslabený rast v stresových podmienkach, majú silnú tendenciu agregovať, zníženú účinnosť transformácie a nie sú schopné tvoriť biofilm v prostredí s glukózou ako primárnym zdrojom uhlíka [88]. Okrem toho bola pri týchto mutantoch pozorovaná zvýšená citlivosť na dezinfekčné látky využívané v ústnej hygiene, ako je chlórhexidín, peroxid vodíka alebo fluorid sodný [90, 91]. Dvojzložkové systémy VicRK (Virulence Control) a CovR (Control of Virulence) navzájom regulujú gény zodpovedné za syntézu a interakciu s extracelulárnymi polysacharidmi (gtfB, gtfC, gtfD, gbpB, gbpC) [92, 93, 94] a gény, ktoré sa podieľajú na biogenéze bunkovej steny, pričom sú špecificky aktivované práve počas rastu vo fáze biofilmu. Transkripčný regulátor VicRK je pozitívnym regulátorom týchto génov [94, 95], zatiaľ čo CovR ich potláča [96]. Deleční mutanti ∆covR vykazujú abnormálnu štruktúru biofilmu, zvýšenú agregáciu buniek a nižšiu schopnosť kariogenicity [97]. Mutantné kmene v géne vicK prejavujú poruchy pri delení buniek a formovaní biofilmu v prostredí so sacharózou [98].

Ústny biofilm je okrem glukánov (10–20 % sušiny) zložený z fruktánov (1–2 %), proteínov (40 %), rôzneho množstva lipidov, vápnika, fosfóru, horčíka, fluóru a približne 80 % vody [99, 100].

SYNTÉZA EXOPOLYSACHARIDOV IN SITU – TVORBA MATRIXU ÚSTNEHO BIOFILMU

Vývoj matrixu ústneho biofilmu bol preskúmaný pomocou fluorescenčných prób počas syntézy GTF exopolysacharidov [74, 79, 101]. Ten pozostáva z niekoľkých krokov (obr. 4). Najskôr sú na povrchoch primárnych kolonizátorov formované počiatočné glukány, ktorými sa baktérie zachytávajú na orálnych povrchoch. Tak dochádza k prvotnej mikrobiálnej kolonizácii a formovaniu bunkových zhlukov. V druhom kroku vedie nepretržitá produkcia glukánov in situ k zväčšovaniu trojdimenzionálneho matrixu biofilmu, pričom sa formuje jadro tvorené bakteriálnymi bunkami a exopolysacharidmi, ktoré slúži ako nosná konštrukcia pri tvorbe mikrokolónií. V treťom kroku biofilm dozrieva, dochádza k ohraničovaniu jednotlivých mikrokolónií glukánmi, čím sa formujú agregáty zložené z viacerých mikrokolónií [101]. Bolo zistené, že S. mutans v rámci viacdruhového biofilmu zvyšuje expresiu génov, ktoré súvisia so syntézou glukánov (gtfB, gtfC), remodelingom týchto enzýmov (dexA) a ich väzbou (gbpB) [102]. Skúmaním dvojitých mutantov S. mutans v génoch gtfB a gtfC sa zistilo, že tieto nedokážu formovať biofilm bohatý na glukány, a tým nedochádza k tvorbe komplexu glukány-mikrokolónie. Tým sa preukázala kľúčová úloha týchto génov pri formovaní orálneho biofilmu baktériou S. mutans [101]. Keďže zubný kaz vzniká v dôsledku rozrušovania zubnej skloviny kyslými produktmi primárnych kolonizátorov, pomocou fluorescenčného pH indikátora inkorporovaného do matrixu biofilmu, bolo merané pH na rôznych miestach orálneho biofilmu. Zistila sa značná variabilita, ktorá môže byť zapríčinená fyzikálnymi faktormi (rozkladanie rozpustných glukánov a fruktánov enzýmami prítomnými v matrixe) alebo faktormi metabolickými (rozdielna metabolická aktivita S. mutans v rámci biofilmu) [69, 103]. Nízke pH bolo zaznamenané vo vnútri komplexov EPS-mikrokolónie a na povrchoch zubov v mieste, kde sa mikrokolónie prichytávajú. Okrem klinického významu nízkeho pH (rozrušovanie zubnej skloviny) dochádza vďaka zníženiu pH taktiež k formovaniu kompaktnejšieho matrixu biofilmu, keďže znížením pH v prostredí dochádza pri S. mutans k zvýšenej tvorbe glukánov [69, 78]. Na inhibíciu glukozyltransferáz bolo už v  minulosti [104] vyskúšaných mnoho chemických zlúčenín, ako sú kvartérne amóniové zlúčeniny, alifatické amíny alebo protilátky. Okrem chemických zlúčenín, boli vyskúšané aj rôzne prírodné látky (zelený čaj, extrakty z rastlín) [105, 106, 107], niektoré ióny (Fe²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺) [108], oxidačné činidlá (chlórňany, bengálska ružová), prípadne biocídy (triclosan cetylpyridínium chlorid) [108]. Ich inhibičná aktivita však bola oveľa vyššia proti voľným enzýmom v roztokoch, ako naviazaným na hydroxyapatitové povrchy. Zatiaľ najúčinnejším inhibítorom GTF enzýmov sa zdá byť extrakt propolisu, ktorý bol účinný proti GtfB a GtfC enzýmom v roztoku, ako aj naviazaným na povrchoch. Presný mechanizmus účinku zatiaľ nie je známy, ale zistilo sa, že na inhibíciu aktivity GTF enzýmov má vplyv štruktúra flavonoidov, ktoré sú hlavnou zložkou propolisu s inhibičným vplyvom na tieto enzýmy. Ako najúčinnejší inhibítor sa preukázal apigenín (4',5,7-trihydroxyflavón). Predpokladá sa, že jeho aktivita súvisí s dvojitou väzbu medzi C-2 a C-3, ktorá nie je prítomná pri iných flavonoidoch s nižšou, prípadne so žiadnou inhibičnou aktivitou. Predpokladá sa, že dochádza k naviazaniu aminokyselín vo vedľajších reťazcoch GTF enzýmov na túto dvojitú väzbu. Tieto aminokyselinové zvyšky sú potrebné na expresiu katalytickej aktivity GTF enzýmov, čo pravdepodobne vedie k inhibícii GTF enzýmov apigenínom [109]. Nedávno bola zaznamenaná úspešná inhibícia syntézy glukánov produkovaných naviazanými GtfB enzýmami pomocou špecifických oligomérov typu proantokyanidínov s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktoré boli izolované z vodného extraktu brusníc. Presný mechanizmus účinku na GTF enzýmy nie je známy, zatiaľ sa vie, že ide o anti-adhezívny účinok [110]. Už niekoľko rokov sa vedci zaoberajú myšlienkou vytvoriť vakcínu proti zubnému kazu s využitím glukozyltransferáz a ich fragmentov ako imunogénnych agens [111, 112, 113, 114]. Lokálna aplikácia slepačích protilátok bola účinná proti glukozyltransferázam typu B, kedy došlo k radikálnemu zníženiu výskytu zubného kazu oproti kontrole u potkanov, avšak nebol pozorovaný účinok na rozpustné glukány syntetizované enzýmom GtfD [115].

Intracelulárne polysacharidy

Produkcia glukánov je dôležitým virulenčným faktorom S. mutans. Okrem vyššie spomínaných exopolysacharidov, produkujú tieto orálne baktérie aj intracelulárne polysacharidy (IPS – Itracellular Polysaccharides). Z hľadiska štruktúry sú IPS polyméry typu glykogén-amylopektín s α-1,4- a α-1,6-glykozidovou väzbou. V bunkách sú akumulované v podobe intracelulárnych granúl [116]. Na syntéze IPS sa pri S. mutans podieľajú najmenej 3 enzýmy: glykogén syntáza, glukózo-1-fosfát pyrofosforyláza a enzým podieľajúci sa na vetvení. Sekvenčná analýza genómu S. mutans naznačuje, že domnelé gény podieľajúce sa na syntéze IPS sú súčasťou glg operónu, ktorý pozostáva z génov glgB-glgC-glgD-glgA-glgP (obr. 5) [117]. Podľa výsledkov prác s inými Gram-pozitívnymi baktériami, gén glgA kóduje glykogén syntázu, glgB je zodpovedný za syntézu glukán vetviaceho enzýmu a gény glgC a glgD kódujú podjednotky glukóza-1-fosfát pyrofos­forylázy [118, 119]. IPS slúžia ako zdroj polysacharidov pre fermentačné procesy v bunkách počas hladovania [120, 121]. Spatafora et al. [122] skonštruovali mutantov S. mutans schopných syntetizovať zvýšené množstvo IPS, ktoré boli hyperkariogénne po infikovaní gnotobiotických potkanov. Toto zistenie podporilo tvrdenia o IPS ako dôležitom virulenčnom faktore pre S. mutans. Proti smeru transkripcie glg operónu leží gén pul, ktorý kóduje enzým pullulanázu, ktorý je zodpovedný za hydrolýzu α-1,6 väzieb v rezervnom polysacharide pulluláne a v iných polysacharidoch [123]. Enzým kódovaný génom pul má na N-terminálnom konci domnelú pullulanázovú doménu a na C-terminálnom konci alfa-amylázovú doménu [123, 124]. Preto okrem pullulánu môže hydrolyzovať amylopektín alebo glykogén [117].

ZÁVER

Ústna dutina vďaka vhodným podmienkam pre život rôznych druhov mikroorganizmov predstavuje husto kolonizovaný biotop. Na orálnych povrchoch vytvárajú kolonizujúce mikroorganizmy plak – orálny biofilm. Pre toto osídlenie sú najdôležitejší primárni kolonizátori, ktorý vďaka súboru virulenčných faktorov sú schopní prichytiť sa na orálnych povrchoch a odolávať nepretržitým zmenám prostredia (prúdenie slín, nárazový prísun živín). Dôležitým primárnym kolonizátorom je S. mutans, ktorý je v súčasnosti považovaný za hlavný etiologický agens zubného kazu. Je to vďaka jeho prirodzenej kompetencii, odolnosti voči kyslým produktom a schopnosti produkovať kompaktný matrix biofilmu, čím je v konkurenčnej výhode oproti iným primárnym kolonizátorom ústnej dutiny.

Do redakce došlo dne 11. 2. 2015.

Adresa pro korespondenci:

doc. RNDr. Helena Bujdáková, CSc.

Univerzita Komenského v Bratislave

Prírodovedecká fakulta, Katedra mikrobiológie a virológie

Mlynská dolina B-2

842 15 Bratislava

Slovenská republika

e-mail: bujdakova@fns.uniba.sk