NK buňky, chemokiny a chemokinové receptory

Souhrn

NK buňky jsou důležitou komponentou přirozené imunity, která zajišťuje obranné reakce proti virům, bakteriálním a parazitárním intracelulárním patogenům a nádorově změněným buňkám. NK buňky jsou schopny rychlé odpovědi bez předchozí senzibilizace a cytotoxická reakce není závislá na přítomnosti antigenů hlavního histokompatibilního systému. NK buňky produkují řadu cytokinů (např. INF‑  γ, GM‑CSF a TNF‑β) a chemokinů a touto cestou regulují jak přirozenou, tak získanou imunitní odpověď. Naproti tomu jsou pozitivně i negativně regulovány cytokiny a chemokiny produkovanými dalšími buňkami imunitního systému. Pozornost je zaměřena na možnost ovlivnění nádorového procesu pomocí NK buněk aktivovaných cytokiny a chemokiny. Ve studiích prováděných na myších modelech, ale i v několika klinických studiích bylo prokázáno, že přítomnost cytotoxických buněk v nádorovém stromatu je asociována s příznivější prognózou nádorového onemocnění. Existuje ale i množství dokladů, že v nádorovém stromatu dochází k produkci řady cytokinů a chemokinů, z nichž mnohé mají ambivalentní efekt.

Klíčová slova:
NK buňky –  chemokiny –  chemokinové receptory –  cytokiny

Úvod

NK buňky jsou důležitou komponentou přirozené imunity, která zajišťuje obranné reakce proti virům, bakteriálním a parazitárním intracelulárním patogenům a nádorově změněným buňkám. Po kontaktu s poškozenou buňkou jsou NK buňky schopny rychlé odpovědi bez předchozí senzibilizace a cytotoxická reakce není závislá na přítomnosti antigenů hlavního histokompatibilního systému [1–2]). NK buňky tvoří pouze 5–10% mononukleárních buněk v periferní krvi. Přesto jsou důležitou složkou přirozené imunity. NK buňky se nacházejí ve všech tělních kompartmentech, jejich zastoupení je však v ně­kte­rých orgánech odlišné. Například v lymfatických orgánech je počet NK buněk až 10krát vyšší než v periferní krvi [3]. Zvýšené počty NK buněk jsou nacházeny i v plicích, játrech nebo slezině [4].

Aktivované NK buňky produkují řadu cytokinů (např. INF γ, GM CSF a TNF β) a chemokinů, které vedou k autokrinní a parakrinní aktivaci buněk podílejících se na imunitní reakci. Touto cestou jsou NK buňky schopny regulovat přirozenou i získanou imunitní odpověď [5–6]. Naproti tomu jsou pozitivně i negativně regulovány jak dalšími buňkami imunitního systému, tak poškozenými anebo nádorově transformovanými buňkami. V experimentálních studiích zabývajících se možností využití NK buněk v protinádorové terapii je zaměřena pozornost na roli chemokinů a jejich receptorů.

Ve studiích prováděných na myších modelech, ale i v několika klinických studiích bylo prokázáno, že průkaz cytotoxických buněk v nádorovém stromatu je asociován s příznivější prognózou onemocnění [7–9]. Přítomnost NK buněk v nádorovém stromatu je považována za jedno z prognostických znamení [10–13]. Naproti tomu existuje řada dokladů, že v nádorovém stromatu dochází také k produkci řady cytokinů a chemokinů, z nichž mnohé mají ambivalentní efekt. Nádorové stroma je z velké části tvořeno makrofágy, které jsou pod regulačním vlivem nádorových buněk a samy produkují mediátory, jež podporují proliferaci nádorových buněk, s nádorem spojenou angiogenezi a metastazování. Navíc chemokiny produkované v místě rostoucího nádoru jsou odpovědny za vstup neutrofilních segmentů. Tyto leukocyty pak po vstupu do stromatu uvolňují další angiogenní faktory, mitogeny a proteolytické enzymy. Tímto mechanizmem vzniká mikroprostředí příznivé pro nádorový růst a založení vzdálených metastáz [14].

NK buňky CD56^+dim a CD56^+bright

Na povrchu NK buněk můžeme prokazovat řadu molekul, které mají funkci receptoru pro cytokiny, chemokiny, a adhezivní molekuly, pomocí nichž je možné NK buňky identifikovat a určovat jejich subpopulace (obr. 1). NK buňky nemají vyjádřen receptor pro T lymfocyty (T cell receptor – TCR), jsou CD3 negativní [15]. Naopak, všechny NK buňky nesou membránovou molekulu CD7. Hlavní pan NK membránovou molekulou je neurální buněčná adhezivní molekula (neural cell adhesion molecule – NCAM) nesoucí označení CD56 [16]. Další povrchovou molekulou vyjádřenou na většině NK buněk je FcRγIII receptor označovaný jako CD16. Na základě exprese těchto dvou molekul rozlišujeme dvě hlavní subpopulace NK buněk, CD56^+dimCD16⁺ a CD56^+brightCD16^dim/–. Tyto subpopulace NK buněk vykazují funkční odlišnosti v odpovědi na stimulaci IL 2, v zastoupení NKR (natural killer receptors), adhezivních molekul a v cytotoxické kapacitě [17–18].

NK buňky CD56^+bright exprimují na svém povrchu vysokoafinní receptor pro IL 2 tvořený řetězci α, β,γ (IL 2Rαβγ) (CD 25, CD122 a CD132) a expandují v in vitro a in vivo podmínkách i po nízkých dávkách IL 2. Naopak CD56^+dim exprimují nízkoafinní receptory pro IL 2 tvořený řetězci α, β a jejich proliferační odpověď je nízká i na vysoké dávky IL 2. Schopnost usmrcovat terčové buňky je u CD56^+dim buněk vyšší než u CD56^+bright. Tato vlastnost CD56^+dim buněk je dána přítomností velkého počtu cytoplazmatických granul obsahujících perforiny a granzimy a vyšší denzitou membránových receptorů pro Fc fragment IgG.

Subpopulace NK buněk mají odlišné zastoupení v jednotlivých tělních kompartmentech, CD56^+bright buňky se nalézají v největším počtu v lymfatických uzlinách, zatímco CD56^+dim jsou většinovou populací v periferní krvi a slezině [3]. Všechny NK buňky CD56^+bright mají vyjádřen s vysokou denzitou membránový receptor CD94/NKG2, který náleží do C typ lecitinové rodiny, a jen malý počet (méně než 10%) těchto buněk exprimuje KIR (killer cell imunoglobulin like receptor). Buňky CD56^+bright mají na svém povrchu přítomny CC chemokinový receptor 7 (CCR7) a s vysokou denzitou CXC receptor 3 (CXCR3). CD56^+bright exprimují také adhezivní molekuly z rodiny L selektinů, které zajišťují vazbu s cévním endotelem a umožňují přesun těchto buněk do sekundárních lymfatických orgánů, kde následně vstupují do interakcí s T lymfocyty [19].

CD56^+dim NK buňky mají v naprosté většině (až 85%) vysoce vyjádřeny KIR receptory a naopak nízkou denzitu CD94/NKG2. Povrchový CCR7 není přítomen, ale silně jsou vyjádřeny CXCR1 a CX3CR1.

Subpopulace NK buněk se liší i v produkci cytokinů, CD56^+bright produkují mnohonásobně vyšší množství IFN γ, TNF β, GM CSF, IL 10, a IL 13 než CD56+dim [17–18,20–21].

Chemokiny a chemokinové receptory

Chemokiny jsou jednou z nejpočetnějších cytokinových rodin, která čítá okolo 50 navzájem si podobných proteinů [22–23]. Jejich současná klasifikace je založena na rozdílném počtu aminokyselin oddělujících cysteinová rezidua na N konci. Rozeznává čtyři skupiny chemokinů: CXC (alfa chemokiny) CC (beta chemokiny), CX3C (delta chemokiny) a C (gama chemokiny). Skupiny CXC a CC se dále dělí na další podskupiny podle strukturálních homologií a bio­logických aktivit [24].

Za označením CC, CXC, CX3C a C následuje označení písmeny L pro ligandy či R pro receptor a na konci je uvedeno číslo, které odpovídá pořadí jeho objevení. Např. chemokin v literatuře často označován jako stromal derived factor 1 je dle klasifikace CXCL12 a jeho receptor je CXCR4 [25–27].

Klasifikace chemokinových receptorů kopíruje dělení chemokinových ligandů. Chemokinové receptory náleží do rodiny receptorů asociovaných s G proteinem tvořeným sedmi transmembránově probíhajícími doménami. G protein je heterotrimerická molekula složená z podjednotek α, β, γ. Prostřednictvím chemokinových receptorů a jejich ligand je uplatňován chemotaktický gradient vedoucí k polarizaci a migraci NK buněk do poškozených tkání.

V experimentálních pracích bylo doloženo, že se jeden chemokinový ligand může vázat na několik receptorů a naopak, jeden receptor může vázat různé chemokiny stejné skupiny. Dosud bylo rozpoznáno téměř 50 chemokinů a bylo popsáno nejméně 18 chemokinových receptorů [25].

Chemokiny hrají důležitou roli v koordinaci přirozené i získané imunitní odpovědi. Regulují pohyb nezralých progenitorových lymfoidních buněk, recirkulaci zralých naivních T  a B  lymfocytů. Chemokiny zajišťují i migraci antigen prezentujících buněk zahrnující jak dendritické buňky, tak i buňky z linií monocytů/mikrofágů. Chemokiny navíc zvyšují afinitu a aviditu β1 a β2 integrinů na povrchů leukocytů k endoteliálním receptorům zahrnující intracelulární adhezivní molekulu 1 a 2 a vaskulární buněčnou adhezivní molekulu 1 [28].

Řada studií prokázala inhibiční efekt chemokinů na růst nádorů. Chemokiny CCL3 CCL21 CCL27 CX3CL1 uvolňované v místě nádoru přitahují cytotoxické T lymfocyty, NK buňky a dendritické buňky, které se podílejí na účinné protinádorové odpovědi [29–33]. Chemokin CCL2 navíc reguluje vstup monocytů/makrofágů do nádorového stromatu a potencuje jejich cytotoxický protinádorový efekt [34]. CX3CL1 zesiluje protinádorovou aktivitu NK buněk [35]. Chemokin CCL5 je široce exprimován na různých imunokompetentních buňkách, včetně aktivovaných NK buňkách, které se podílejí na inhibici nádorového růstu [36].

Chemokinové receptory na NK buňkách

Podle Cambella et al většina NK buněk silně exprimuje receptory CXCR1, CXCR4 a CX3CR1, naopak receptory CXCR2 a CXCR3 jsou podle jejich pozorování vyjádřeny slabě [37]. Práce jiných autorů však popisuje nález pouze receptoru CXCR4, a ne CXCR1, CX3CR1, CXCR2 a CXCR3 [38].

Naopak v případě receptorů pro CC chemokiny se shodují závěry dvou studií v absenci receptorů CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8 a CCR9 na povrchu klidových NK buněk. K zvýšení exprese receptorů CCR2, CCR4, CCR5 a CCR8 dochází až po in vitro aktivaci IL 2 nebo IL 15 [37–38].

Přítomnost povrchových receptorů pro chemokiny se u NK buněk liší podle exprese CD16 molekuly. NK buňky CD16⁺ mají silně vyjádřené molekuly CX3CR1, CXCR1 a CXCR4, slabě exprimované CXCR2 a CXCR3 molekuly, receptory CCR1–7, CCR9 a CXCR5 nejsou přítomny. Na NK buňkách CD16^– není membránový receptor pro CXCR1 detekován a receptor pro CX3CR1 je přítomen v nízké denzitně, zatímco receptory CCR5, CCR7, CXCR3 a CXCR4 jsou silně vyjádřeny. Membránové molekuly CCR1–4, CCR6, CCR9 a CXCR2 nejsou na CD16^– NK buňkách detekovány [37].

Vliv chemokinů na chemotaxi NK buněk

Nádorová tkáň je tvořena nejen nádorovými buňkami, ale i buňkami stromálními. Zatímco makrofágy a fibroblasty jsou nalézány v nádorovém stromatu konstantně, přítomnost ostatních populací imunokompetentních buněk je proměnlivá. Je prokázáno, že zánětlivá reakce a nádorový růst jsou úzce spojeny a v řadě případů mají i prognostický význam. Nález lymfocytárního infiltrátu v melanomové tkáni je spojen s příznivou prognózou, zatímco v případě karcinomu prsu je přítomnost zánětlivého infiltrátu spojena s horší prognózou.

Nádorové mikroprostředí určované interferony, interleukiny a zvláště chemokiny je rozhodující pro charakter zánětlivé reakce. Vlivem chemotaktického gradientu nádorového mikroprostředí jsou přitahovány T lymfocyty, dendritické buňky, granulocyty, makrofágy i NK buňky. Všechny uvedené buňky mohou produkovat chemokiny a spolu s chemokiny tvořenými nádorovými buňkami mají určující vliv na charakter zánětlivé reakce. Rozhodují o tom, zda imunitní odpověď povede jako v případě melanomu k rejekci nádoru, nebo naopak zvýší invazivitu a metastazování tumoru pozorované u infiltrativního nádoru prsu [39].

Intracelulární signální cesty indukované chemokiny v NK buňkách

Přenos signálu zprostředkovaným chemokinem lze rozdělit do tří kroků: 1. navázání chemokinu na receptor a interakce s G proteinem, 2. aktivace intracelulární efektorové molekuly, 3. inaktivace receptoru [40] (obr. 1).

Receptory pro chemokiny náleží do rodiny molekul tvořených sedmi transmembránovými doménami, které jsou na COOH konci asociovány s G proteinem. Mezi N koncem (extracytoplazmatický) a COOH koncem (intracytoplazmatický) je sedm transmembránových hydrofobních oblastí receptoru. Vně membrány se nachází tři extracelulární domény a uvnitř tři intracelulární hydrofilní domény. COOH konec je bohatý na serin/treonin, které jsou po navázání ligandu fosforylovány.

Protein G je tvořen třemi podjednotkami α, β, γ. Po navázání ligandu na extracelulární část molekuly dojde ke konformačním změnám hydrofobních oblastí, což je důležité pro zvýšení vazebné afinity k alfa podjednotce heterotrimerického G proteinu. Následně, alfa podjednotka změní svou konformaci, což umožní navázání GTP. Po této vazbě nastane odštěpení b,g podjednotky od a podjednotky. Prostřednictvím GTP a podjednotky dochází k aktivaci fosfolipázy C a adenylát cyklázy [41]. Adenylát cykláza je aktivována Gas proteinem a inhibován Gai, zatímco fosfolipáza C je aktivována Gaq. Jako sekundární messengery jsou uplatněny v případě adenylát cyklázy cAMP a v případě fosfolipázy C diacylglycerol a inositol 1,4,5 trifosfát. Zpětnovazebná regulace chemokinových receptorů probíhá dvěma způsoby. První možností je hydrolýza GTP a na GDP a GTPázou, s následnou rekonstitucí heterotrimerického Gαβγ proteinu. Druhou cestou je inaktivace zprostředkovaná kinázou vázající se na b,g podjednotku G proteinu. Tato kináza fosforyluje COOH konec receptoru vázaného s G proteinem a způsobí cestou b arrestinu, c Src kinázou, dynaminu a clathrinu endocytózu receptoru [40,42].

Závěr

V průběhu nádorového onemocnění jsou aktivovány jak cytotoxické buňky (cytotoxické T lymfocyty a NK buňky), tak další buněčné populace (makrofágy, dendritické buňky, B lymfocyty), které mají společně s nádorovými buňkami zásadní vliv na charakter protinádorové imunitní odpovědi. Přítomnost aktivovaných NK buněk ještě není důkazem účinné protinádorové odpovědi. Pro klinické využití NK buněk jsou nezbytné detailní znalosti bio­logických vlastností chemokinů a jejich receptorů a jejich vlivu na nádorové mikroprostředí.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.
The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, pruducts, or services used in the study.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.
The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers.

MUDr. Jindřich Kopecký
Klinika onkologie a radioterapie
FN Hradec Králové
Sokolská 581
500 05 Hradec Králové
e-mail: kopecjin@fnhk.cz