Molekulární podstata Waldenströmovy makroglobulinemie

Souhrn

Waldenströmova makroglobulinemie je raritní lymfoproliferativní onemocnění ze skupiny lymfomů vyskytující se s četností asi tří případů na milion osob. Podíl na všech krevních nádorových onemocněních je 1 až 2 %. Toto onemocnění je charakterizováno infiltrací kostní dřeně klonálními B lymfocyty a přítomností monoklonálního imunoglobulinu třídy IgM v séru. Waldenströmova makroglobulinemie stále zůstává nevyléčitelným onemocněním s mediánem přežití 5 let. Molekulární podstata onemocnění je neobjasněná, i když delece 6q, trizomie chromozomů 4 a 8, delece 13q a zvýšená exprese IL-6 se zdají být typické pro toto onemocnění. Nejvýznamnějšími změnami na úrovni mikroRNA se zdají být zvýšená exprese miR-155 a snížená exprese miR-9*. Souhrn současných znalostí o molekulární podstatě WM je předmětem této práce.

Klíčová slova:
Waldenströmova makroglobulinemie – IL-6 – SDF-1 – BLyS – PI3K/Akt – NF-κB – JAK/STAT

Úvod

V roce 1944 švédský profesor Jan Gosta Waldenström popsal případy dvou pacientů s krvácením z dutiny ústní a nosní, zvětšenými mízními uzlinami, sníženým počtem červených krvinek a krevních destiček, zvýšeným stupněm sedimentace červených krvinek, vysokou viskozitou séra a zvýšeným počtem lymfoidních buněk v kostní dřeni [1]. Dále si všiml, že pacienti nepociťují bolest v kostech a ani kardiograf neobsahuje žádný nález, který je charakteristický pro mnohočetný myelom. Vysokou viskozitu krve připsal abnormální hladině vysokomolekulárních sérových proteinů. Toto prvotní pozorování položilo základy výzkumu onemocnění, jež nese jeho jméno – Waldenströmova makroglobulinemie (WM).

WM je lymfoproliferativní onemocnění lymfoplazmatických buněk charakterizované zvýšenou expresí imunoglobulinu IgM [2]. Jedná se o raritní onemocnění, které svojí četností zaujímá 1–2 % krevních nádorových onemocnění. Tato nemoc se nejčastěji vyskytuje mezi 63. a 68. rokem života a její incidence s rostoucím věkem stoupá [3]. Zvyšující se podíl nových případů u starších osob lze interpretovat jako výsledek postupné poruchy imunitního systému.

Mezi klinické příznaky této nemoci patří chronická únava, krvácení z dutiny ústní a nosní, bolesti hlavy, kožní purpura a neuropatie. V současné době je WM stále nevyléčitelné onemocnění s mediánem přežití 5 let. Z tohoto důvodu se léčba zaměřuje hlavně na potlačení příznaků s minimálním poškozením vnitřních orgánů [2].

Doposud bylo vydáno mnoho publikací popisujících klinické výsledky léčby WM, stále přibývá aplikací molekulárně--biologických přístupů, které by mohly blíže objasnit biologickou podstatu a progresi nemoci, nicméně kompletní pochopení genetického základu a aktivity klíčových signálních drah u WM stále chybí. V tomto článku shrnujeme současné znalosti o molekulární podstatě onemocnění.

Genetické abnormality

Nízký proliferační index buněk WM byl historicky největším problémem při studiu genetické podstaty onemocnění. První nahlédnutí do genomu WM umožnily přístupy klasické cytogenetiky, které však byly často neúspěšné z důvodu nízké rozlišovací schopnosti a požadavku na dělící se buňky [4,5]. Teprve nástup nových technik umožňujících analýzu buněk v interfázi (I-FISH) nebo celogenomový přístup jako GEP, a-CGH nebo sekvenování dovolily provádět pokusy bez nutnosti dělení buněk. Srovnávací celogenomové přístupy umožňují kompletní testování na úrovni DNA, RNA a mikroRNA (miRNA). Mezi nalezené abnormality u WM patří jak cytogenetické změny, tak změny postihující expresi kódujících genů nebo nekódujících RNA, jako jsou mikroRNA.

Cytogenetické aberace

Delece dlouhého raménka chromozomu 6 byla pomocí metody FISH v různých studiích pozorována jako nejčastější strukturální aberace u WM. Pacienti s bezpříznakovou formou makroglobulinemie mající deleci 6q rychleji přecházejí do symptomatické formy nemoci [6]. V další práci bylo zjištěno, že tato delece není přítomna u MGUS typu IgM, zatímco se vyskytovala u 55 % případů WM. Přítomnost delece 6q tedy může odlišit WM od IgM MGUS [7].

Trizomie dlouhých ramének chromozomů 4 a 8 se zdají být specifickými chomozomálními aberacemi WM. Byly identifikovány u 12 %, respektive 10 % pacientů s WM, zatímco u ostatních příbuzných lymfoproliferativních onemocnění tyto aberace pozorovány nebyly. Trizomie chromozomu 4 byla identifikována nezávisle na stavu 6q chromozomu. Bohužel zatím na 4q a 8q nebyly nalezeny žádné potenciálně důležité geny pro patofyziologii WM [8].

Mezi další nalezené abnormality patří delece 13q detekované u osob s pokročilou chorobou a výskyt trizomie chromozomu 5 v méně než 10 % případů [7]. Ostatní aberace typické pro příbuzná lymfoproliferativní onemocnění, jako např. ztráta RB1 nebo přesmyk lokusu pro těžký řetězec imunoglobulinu IgM, byly detekovány vzácně v 9–16 %, resp. 3–14 % [7,9].

Deregulace genů a proteinů u WM

Komplexní vyšetření základních molekulárních změn u WM bylo umožněno zavedením analýzy genové exprese. Zatím bylo publikováno málo prací, které by se zabývaly změnami genové exprese, které by odlišily WM od ostatních onemocnění. V jedné z těchto prací bylo popsáno celkem 73 genů, jejichž exprese se lišila ve srovnání se zdravými kontrolami, ale i CLL a MM. Z těchto 73 genů mělo 48 genů zvýšenou a 25 sníženou expresi. Výrazně nejvyšší expresi měl gen pro cytokin IL-6 [10]. Klonální buňky B lymfocytů u pacientů s WM spontánně diferencují in vitro na plazmatické buňky právě pomocí IL-6. Tento objev vede k přesvědčení, že hladina IL-6 může být markerem odrážejícím postižení a odpověď na léčbu WM [11]. Nicméně vzhledem k posttranslačním úpravám neodpovídá profil genové exprese vždy změnám na úrovni hladin proteinů [12].

Nově bylo metodou celogenomového sekvenování vzorků 30 pacientů s WM zjištěno, že až 26 případů mělo mutaci v genu MYD88, která vede k záměně leucinu za prolin v kodonu 265 (L265P). Mutace v MYD88 genu by mohla být potenciálním markerem odlišujícím WM od jiných lymfoproliferativních onemocnění [13,14].

Pomocí proteomické analýzy bylo nalezeno celkem 185 polypeptidů, které mají zvýšenou (111/185) nebo sníženou (74/185) hladinu. Mezi těmito deregulovanými proteiny se nacházely polypeptidy zapojené do regulace buněčného cyklu (CDK2), histon deacetylázy (HDAC3) a modulátory apoptózy [15].

Z různých genů lokalizovaných na 6q21 je BLIMP-1 považován za důležitý ve vývoji WM. Je to nádorový supresor, hlavní regulátor proliferace a diferen­ciace B lymfocytů. Usnadňuje přechod ze zralého B lymfocytu do buňky plazmatické. Částečná nebo úplná ztráta tohoto genu vede k predispozici k lymfoproliferativním onemocněním, jako například WM [16–18].

Mezi další geny umístěné na 6q patří TNFAIP3, který kóduje A20, což je protein se strukturou zinkového prstu, který působí jako negativní regulátor signální dráhy NF-κB [8]. Svojí činností negativně reguluje některé proteiny, jako např. TRAF6 nebo IKKγ, které aktivují IκB kinázu [19,20]. Bialelické delece nebo inaktivující mutace tohoto negativního regulátoru mají za následek aktivaci NF-κB [8].

Dalším genem ovlivňujícím NF-κB signální dráhu je TRAF3. Ten kóduje ubiquitin ligázu, která hraje důležitou roli v negativní regulaci nekanonické dráhy NF-κB [21]. Ztráta TRAF3 vede k akumulaci serin/treonin proteinkinázy NIK, což aktivuje nekanonickou dráhu NF-κB [22].

MikroRNA s pozměněnou expresí u WM

MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující řetězce RNA dlouhé 21–25 nukleotidů, které se podílejí jak na regulaci proliferace, diferenciace a apoptózy [23], tak na iniciaci a progresi nádorů [24]. U pacientů s WM byla zjištěna deregulovaná exprese některých miRNA, a to především zvýšená exprese miR-363*, miR-206, miR-494, miR-155, miR-184, miR-542-3p a snížená exprese miR-9* [25]. Významnou roli hraje miR-155. Její onkogenní funkce přispívá ke zvýšení exprese inhibitorů cyklin-dependentních kináz (p18, p19, p21, p27), snížení exprese cyklin-dependentních kináz CDK-2, CDK-4, CDK-6 a cyklinů D1, D2, D3 a E a nakonec zvýšení exprese p53 a snížení exprese jeho negativního regulátoru Mdm2 [26]. Snížením hladiny miR-155 byla u WM redukována adheze, migrace i proliferace nádorových buněk. Dále bylo zjištěno, že zvýšená exprese miR-206 a snížená exprese miR-9* ovlivňují transkripci genů zodpovědných za modifikaci histonů. Obnovení hladiny miR-9* pomocí transfekce prekurzorů miRNA do buněk WM vedlo k indukci cytotoxicity u buněk WM. Tato zjištění by se dala v budoucnu potenciálně využít pro výrobu syntetických miRNA jako nové varianty léčby pacientů s WM [25,27].

Signální dráhy dysregulované u WM

Interakce buněk WM s kostní dření vede k aktivaci signálních drah, jako jsou PI3K/Akt, NF-κB a JAK/STAT. Tyto dráhy jsou rozhodující pro buněčnou proliferaci, buněčný cyklus, rezistenci na léky, stejně tak jako pro šíření a migraci buněk [28–31].

PI3K/Akt signální dráha

U pacientů s WM byla pozorována zvýšená hladina proteinů PI3K/Akt signální dráhy (obr. 1) [15]. Mezi nejvýznamnější substráty serin/treonin kinázy Akt patří kináza mTOR. Jedním z mechanizmů, kterým může Akt přispívat k rozvoji nádorových buněk, je vliv na progresi buněčného cyklu ve spojení s jeho možnou antiapoptotickou aktivitou [32]. Buněčnou progresi řídí zvýšením exprese mRNA, které kódují pozitivní regulátory buněčného cyklu, jako jsou např. cyklin D1 a c-Myc, nebo naopak snížením exprese negativních regulátorů, jako jsou např. inhibitory cyklin-dependentních kináz [33].

Kináza Akt mimo jiné fosforyluje také Mdm2, což je hlavní inhibitor transkripčního faktoru p53 [34]. Protein p53 transkripčně aktivuje expresi p21, který inhibuje cyklin-dependentní kinázy [35]. To má za následek sníženou fosforylaci pRb (retinoblastoma protein), který inhibuje transkripční faktor E2F. Tím je znemožněna exprese genů, které jsou nutné pro vstup do S-fáze buněčného cyklu [36]. Kromě zastavení buněčného cyklu může p53 také indukovat tvorbu proteinů, které dokážou uvolnit apoptické signály z mitochondrií do cytoplazmy. Poté následuje kaskáda dějů vedoucích k buněčné smrti [37]. V tomto případě PI3K/Akt signální dráha inhibuje aktivitu p53 transkripčního faktoru, což má za následek umlčení apoptických signálů [38].

NF-κB signální dráha

Signální dráha NF-κB (obr. 2) zahrnuje skupinu transkripčních faktorů, které regulují transkripci stovek genů ovlivňujících záněty, vrozenou imunitu, růst buněk a apoptózu [39]. Přestože data o jeho působení u WM jsou omezená, existují důkazy, že NF-κB signální dráha je v buňkách WM aktivována [40,41].

Důležitým aktivátorem této dráhy je proteinkináza Akt, která nepřímo aktivuje NF-κB pomocí fosforylace IκB kinázy alfa (IKKα), čímž způsobí degradaci inhibitoru IκBα, který je ubiquitován a degradován protazomem [42,43].

Transkripčními faktory dráhy NF-κB jsou homo a heterodimery z rodiny Rel proteinů: NF-κB1 (p50), NF-κB2 (p52), RelA (p65), RelB a c-Rel. V regulaci NF-κB komplexů jsou zahrnuty dvě signální dráhy (kanonická a nekanonická), které jsou zodpovědné za aktivaci p50 a p52 z jejich inaktivních prekurzorů p105 a p100 [44,45]. Aktivace těchto drah má za následek translokaci p50/RelA a p52/RelB komplexů do jádra a následnou transkripční aktivaci cílových genů, které mimo jiné zvyšují přežití buňky, inhibují apoptózu a omezují činnost proteinů z proapoptické rodiny BCL-2 [46–48].

JAK/STAT signální dráha

Hatjiharissi et al (2007) ve své studii zjistili zvýšené množství proteinů JAK a STAT u WM ve srovnání se zdravými kontrolami [15]. Svojí aktivitou tato signální dráha navozuje expresi genů podílejících se na potlačení apoptózy, progresi buněčného cyklu a rezistenci na chemoterapeutické látky [49,50]. Některé studie nasvědčují tomu, že stimulace této dráhy může taktéž hrát důležitou roli ve zvýšené produkci IgM u WM [51].

JAK/STAT signální dráha (obr. 3) může být aktivována cytokiny produkovanými jak samotnými nádorovými buňkami, tak i zdravými buňkami nádorového mikroprostředí [52]. Mechanizmus aktivace této dráhy je asi nejlépe popsaný pomocí cytokinu IL-6 [53]. Po navázání IL-6 na buněčný receptor gp130 je pomocí JAK fosforylace aktivován transkripční faktor STAT, který v jádře zprostředkovává expresi mnoha genů. Trvale fosforylovaný STAT mimo jiné interaguje s cytosolovými proteiny, což aktivuje některé další signální dráhy, které jsou aktivní u krevních nádorových onemocnění, jako jsou např. Pl3K/Akt či MAPK/ERK [54–56].

Pouze intenzivní výzkum v této oblasti může v budoucnosti potvrdit a upřesnit vliv JAK/STAT signální dráhy na patogenezi WM, a to zejména efekt jejich cytokinů na zvýšenou sekreci IgM [51].

Mikroprostředí kostní dřeně u WM

Adhezivní molekuly

Mezi hlavní skupiny adhezivních molekul jsou řazeny adheziny patřící do rodiny imunoglobulinů, integriny, kadheriny a selektiny [57–59]. Ukázalo se, že integriny jako např. VLA-4 a LFA-1 mají u WM zvýšenou expresi. Adheze buněk WM k fibronektinu a dále k endoteliálním a stromálním buňkám je regulována právě integrinem VLA-4. Ten mimo jiné interaguje s CXCR4, což naznačuje spojitost mezi adhezí a migrací. Navázání protilátky na VLA-4 vedlo k inhibici adheze k fibronektinu, stromálním a endoteliálním buňkám in vitro [60]. Potenciální klinické využití interakcí CXCR4 a VLA-4 u WM ještě nebylo dostatečně prozkoumáno [61].

Cytokiny

U WM bylo popsáno celkem 13 chemokinových receptorů CXC a CC. Nejvyšší exprese byla stanovena u CXCR4, jehož inhibice vedla ke značnému snížení migrace a adheze buněk WM. Ligand tohoto receptoru SDF-1 (označovaný i jako CXCL12) má vyšší expresi jak v kostní dřeni, tak v periferní krvi pacientů WM ve srovnání se zdravými kontrolami. SDF-1 je primárně produkován stromálními buňkami. Interakce SDF-1 s CXCR4 na povrchu buněk WM vede k migraci a adhezi těchto buněk do mikroprostředí kostní dřeně [60,62].

Makrofágový zánětlivý protein (MIP-1α) je členem CC chemokinové rodiny. Je produkován všemi hematopoetickými a stromálními buňkami. MIP-1α je jedním z nejsilnějších aktivátorů osteoklastů a podílí se na patogenezi mnohočetného myelomu (MM) [63]. Právě osteoklasty jsou zodpovědné za tvorbu lytických lézí u MM. Naopak u WM byly lytické léze pozorovány jen vzácně, i přesto, že je hladina MIP-1α u nemocných zvýšená [64,65]. Ojediněle byly pozorovány mikroskopické léze, které byly způsobeny abnormální remodelací kosti v blízkosti nádorových buněk WM [66]. Bylo prokázáno, že u MM je navíc zvýšená produkce DKK-1, což je protein produkovaný nádorovými plazmatickými buňkami, který potlačuje aktivitu osteoblastů [67]. Tato zjištění podporují představu, že nadměrná resorpce kosti je u WM přítomná ve stejném rozsahu jako u MM, ale díky normální tvorbě kostní tkáně nedochází k tvorbě lytických lézí [66].

Další oblast zájmu u WM zaujímá stimulátor B lymfocytů (BLyS), také známý jako B buněčný aktivující faktor z rodiny TNF [68]. Tento cytokin je exprimován na povrchu monocytů a je rozhodující pro udržování normálního vývoje B lymfocytů a homeostázy [69,70]. Elsawa et al (2006) zjistili, že hladina BLyS v séru je značně vyšší u pacientů s WM než u zdravých kontrol. Ať už samotný, nebo v kombinaci s některými cytokiny, svojí aktivitou podporuje sekreci IgM u nádorových buněk WM. Jeho inhibice má terapeutický potenciál a další výzkumy mohou potvrdit její léčebnou účinnost u pacientů s WM [71].

Enzymy

Src tyrozin kináza se účastní různých buněčných pochodů, jako proliferace, adheze, migrace, invazivita a usídlení buněk. Src je aktivována receptory růstových faktorů, cytokinovými receptory a fokální adhezivní kinázou (FAK) [72]. Src interaguje se sítí intracelulárních drah, včetně PI3K/Akt a JAK/STAT signalizace [73]. Ngo et al (2009) dokázali, že Src tyrozin kináza má u WM zvýšenou expresi, stejně jako je tomu u velkého počtu lidských nádorů. Navíc tato studie naznačuje, že Src tyrozin kináza řídí adhezi a migraci buněk WM [60].

Abnormální exprese hyaluronan syntázy (HAS) je uváděna jako možný patogenetický faktor u WM [74]. Hyaluronan se podílí na migraci a metastazování nádorových buněk. U 3 HAS izoenzymů detekovaných u člověka Adamia et al (2003) zjistili, že nadprodukce HAS1 a HAS3 hyaluronanového matrixu okolo WM buněk zamezuje jejich eliminaci imunitním systémem, a tím podporuje šíření onemocnění. Další práce dokládá, že jednonukleotidový polymorfizmus v genu HAS1 zvyšuje riziko vývoje WM [75].

Původ a imunofenotyp nádorových buněk WM

Imunofenotypový profil v kombinaci s přítomností somatické hypermutace genu pro těžký řetězec imunoglobulinu IgM, ale bez intraklonální diverzity nejvíce napovídá tomu, že nádorové buňky WM pocházejí z buněk posledního stadia diferenciace zralého B lymfocytu do plazmatické buňky [76]. K tomuto názoru se přiklánějí i Walsh et al (2005), kteří ve své práci popsali, že klonální populace nádorových buněk WM je odvozena z B lymfocytů, které jsou zachyceny v germinálním centru těsně po somatické hypermutaci, ale ještě před terminální diferenciací do plazmatické buňky [77]. Klonální populace, dle stanovení povrchové a cytoplazmatické exprese lehkých Ig řetězců, je tvořena nejčastěji směsí zralých B lymfocytů diferencujících do lymfoplazmocytoidních buněk a méně zralých plazmocytů, přičemž zastoupení jednotlivých subpopulací se mezi jednotlivými pacienty liší. Klonální B lymfocyty, které u WM převažují, jsou charakteristické expresí povrchového imunoglobulinu IgM a dále exprimují typické pan-B znaky: CD19, CD20, CD22 a CD79a, u kterých může docházet ke snížení intenzity exprese. Exprese znaku CD27 i ostatních dále zmiňovaných markerů je v rámci jednotlivých pacientů heterogenní. Na rozdíl od jiných B lymfoproliferací WM B lymfocyty obvykle neexprimují CD5, CD10, CD11c a CD23 [78]. Dalšími často se vyskytujícími znaky jsou CD25, CD27, FMC7 a CD52, nicméně exprese znaků CD103 a CD138 je vzácná [79]. Pro lymfoplazmocytoidní buňky je charakteristická silná exprese CD38 a častá pozitivita na CD20, zatímco CD138 chybí. Plazmocytární komponenta exprimuje znak CD138 s nižší intenzitou než normální PC, ale zachovává si expresi CD19 i CD27 a chybí CD56. Přestože se tedy jedná o klonální buňky, jejich fenotypový profil je obdobný jako u normálních PC.

Izolace jednotlivých subpopulací pomocí fluorescencí aktivovaného buněčného třídění (FACS) a jejich další studium může napomoci výzkumu molekulární podstaty onemocnění.

Závěr

Dnes je Waldenströmova makroglobulinemie definována pomocí WHO klasifikace jako lymfoplazmocytární lymfom infiltrující kostní dřeň, který produkuje monoklonální gamaglobulin typu IgM. Ke vzniku nádorových buněk zřejmě dochází během diferenciace posledního stadia B lymfocytu na plazmatickou buňku. Napovídá tomu jak imunofenotyp, tak i přítomnost somatické hypermutace genu pro těžký řetězec, které chybí intraklonální diverzita. Výzkum molekulární podstaty onemocnění v posledním desetiletí pomohl objasnit některé změny nádorových buněk, přesto doposud nebyla nalezena změna, která by jednoznačně definovala tuto chorobu. Nejčastější chromozomovou aberací je delece 6q. Právě v této oblasti leží nádorový supresor BLIMP-1, který hraje důležitou roli při přechodu zralého B lymfocytu do plazmatické buňky. Dalšími důležitými geny v patofyziologii WM jsou TRAF3 a TNFAIP3. Delece těchto dvou genů způsobuje aktivaci NF-κB signální dráhy, což má za následek inhibici apoptózy u nádorových buněk WM. Nejvýznamnějšími změnami na úrovni miRNA se zdají být zvýšená exprese miR-155 a snížená exprese miR-9*. V dnešní době je největší výzvou najít nové strategie pro léčbu WM a právě signální dráhy zahrnující MYD88, NF-κB a Akt-mTOR se zdají být slibnou cestou pro nalezení nových terapeutických cílů. Faktem zůstává, že další in vitro a in vivo pokusy jsou nutné k plnému porozumění patogeneze tohoto značně heterogenního onemocnění.

Mgr. Sabina Ševčíková, Ph.D.

Babákova myelomová skupina

Ústav patologické fyziologie

LF MU Brno

Kamenice 5, A3

625 00 Brno

e-mail: sevcik@med.muni.cz

Obdrženo: 29. 8. 2012

Přijato: 7. 10. 2012