Adenovírusové vektory v génovej terapii

Súhrn

Tento článok je zameraný na génovú terapiu, špeciálne na adenovírusové vektory a ich vzťah k imunitnej odpovedi. Adenovírusové vektory patria k najviac využívaným nosičom genetického materiálu pri génovej terapii, štúdiu expresie génov či imunoterapii. Dôležitou otázkou pri in vivo používaní je ich vplyv na organizmus. Štúdium ich imunomodulačných vlastností je preto veľmi významná oblasť výskumu, vďaka ktorej je možné adenovírusové vektory progresívne upravovať a tak zefektívniť ich potenciál pre využitie v praxi.

Kľúčové slová:
génová terapia –  adenoviridae –  imunitný systém

Úvod

Génová terapia ako horizontálny prenos génov bola prvýkrát skoncipovaná v 70. rokoch minulého storočia s nástupom technologických možností vnášania genetického materiálu do eukaryotických buniek [1]. „Prísna“ génová terapia je založená na koncepte nahradenia defektného génu vnesením a integráciou jeho funkčnej verzie. Z tohto dôvodu bola génová terapia vyvíjaná hlavne voči genetickým chorobám spôsobeným deficienciou jedného génu [2], ako napr. recesívne enzymatické poruchy. Avšak v dôsledku mnohých genetických abnormalít, simultánnych po­rúch viacerých génov pri vzniku tumorov nie je možné aplikovať prísnu génovú terapiu pri liečbe rakovinových ochorení. Preto sa génová terapia rakovinových ochorení sústreďuje najmä na vnesenie genetického materiálu s terapeutickými účinkami do tumoru, na zničenie rakovinových buniek a posilnenie imunitnej odpovede voči nim [3]. Hlavnými študovanými prístupmi v génovej terapii určenej na liečbu nádorových ochorení sú:

1. Vnesenie „samovražedného génu“ na konvertovanie pro‑liečiva v tumore na liečivo a následné usmrtenie nádorových buniek. V klinických štúdiách sa testuje napr. tymidín kináza herpes simplex vírusu (HSV‑ tk), ktorá fosforyluje gancyklovir, čo vedie k terminácii DNA syntézy [4].
2. Vnesenie imunomodulátorov, cytokínových génov na pritiahnutie a aktiváciu imunitných buniek. Príkladom je adenovírusový vektor nesúci TNF‑α, pod kontrolou chemoradiačne inducibilného promótora, ktorý je súčasťou klinických štúdií [5].
3. Vnesenie tumor‑ supresorových génov na naprogramovanie apoptózy v tumorových bunkách, ako napr. adenovírusový vektor nesúci gén TP53, ktorý sa testuje v klinických štúdiách (pokročilá rakovina ústnej dutiny) [6].
4. Vnesenie onkolytických vírusov špecificky lyzujúcich tumorové bunky. V klinických štúdiách II. fázy bol na liečbu metastatického malígneho melanómu použitý OncoVex –  onkolytický herpes simplex vírus kódujúci stimulujúci faktor pre granulocyty/ makrofágy (GM‑CSF) [7].
5. Vnesenie microRNA (miRNA), slúžiacej na umlčanie cieľových génov, napr. onkogénov [3,8]. V súvislosti s vylepšovaním onkolytických vírusov sa experimentálne testuje aj miRNA, ktorá sa používa na prevenciu replikácie vírusu v zdravých bunkách [9].

Typy vektorov

Efektivita génovej terapie v značnej miere závisí od voľby vektora. Vo vše­-obecnosti môžeme vektory používané pri génovej terapii rozdeliť na dve hlavné skupiny: vírusové a nevírusové. Vírusy si evolúciou vyvinuli efektívny spôsob infikovania buniek, narušenia bunkovej obrany a expresie ich génov v bunkách. Tieto ich prirodzené vlastnosti boli využité a upravené genetickým inžinierstvom na veľmi výkonné systémy na vnesenie cudzorodých génov pomocou vírusov do buniek, tzv. transdukciu buniek. Nevírusové vektory sú atraktívnou alternatívou k vírusovým vektorom vďaka ich bezpečnosti, univerzálnosti a ľahkej príprave. Môžeme ich rozdeliť na štyri hlavné skupiny: čistá DNA, lipozómy, syntetické polyméry a nanočastice. Hlavnou nevýhodou všetkých štyroch skupín je však veľmi nízka efektivita transfekcie in vivo. V tomto článku sa budeme venovať vírusovým vektorom, hlavne adenovírusovým vektorom, ktoré boli podľa Ginn et al (2012) celosvetovo najviac využívanými génovými vektormi v klinických štúdiách (graf 1) [10].

Vírusové vektory

Vírusové vektory sa podľa mechanizmu ich pôsobenia rozdeľujú na onkolytické vírusy a replikačno‑ deficientné vírusové vektory.

Onkolytické vírusy

Onkolytické vírusy sú replikačno‑ kompetentné, čo znamená, že gény zodpovedné za ich replikáciu sú zachované, čo je hlavný rozdiel oproti replikačno‑ deficientným vírusovým vektorom. Terapeutické využitie onkolytických vírusov je založené na selektívnej efektivite ich replikácie v nádorových bunkách. Každý vírus má špecifický bunkový tropizmus, ktorý determinuje, aký typ buniek bude daný vírus infikovať (rabies –  infikuje a ničí neuróny, hepatitida B –  hepatocyty). Mnohé vírusy majú preferenčný, avšak nie exkluzívny tropizmus k nádorovým bunkám. Pravdepodobne je to dôsledok tumorovej bio­lógie, keďže mnoho tumorov sa vyhýba detekcii a deštrukcii imunitným systémom a majú tiež porušené apoptotické mechanizmy a translačnú supresiu, čo sú kľúčové odpovede, ktoré využívajú zdravé bunky na potlačenie vírusovej infekcie. Onkolytické vírusy môžu taktiež využívať zmeny v metabolizme a bunkovom cykle tumorových buniek [11]. Schopnosť onkolytických vírusov usmrtiť nádorové bunky sa nazýva vírusová onkolýza. Onkolytické vírusy môžu zničiť infikované nádorové bunky mnohými spôsobmi –  od priamej vírusovo‑ sprostredkovanej cytotoxicity až po množstvo indukovaných imunitných mechanizmov. Hlavné typy onkolytických vírusov sú: podmienečne replikatívne adenovírusy, herpes simplex vírus 1, 2 (HSV‑ 1, HSV‑ 2) a variant vírusu osýpok [8]. Ďalším používaným vektorom je vírus vakcínie, pričom je zaujímavé, že niektoré jeho kmene majú prirodzený tropizmus k tumorovým bunkám (1 000– 10 000-krát vyššia expresia vírusu než v iných tkanivách). V tejto súvislosti sa tiež študujú Sindibis vírus, reovírusy, parvovírusy a myxomavírusy [12]. Replikačno‑ kompetentné vírusy môžu byť ďalej modifikované a exprimovať transgén tzv. armed oncolytic viruses. Príkladom je OncoVex, onkolytický herpes simplex vírus kódujúci stimulujúci faktor pre granulocyty/ makrofágy (GM‑CSF) [7]. Niektoré onkolytické vírusy (napr. onkolytické formy atenuovaného vírusu vakcínie, onkolytický herpes simplex vírus oHSV G47∆, adenovírus ONYX‑ 015) sa využívajú aj v kombinácii s tradičnou rádioterapiou a chemoterapiou, kde bolo preukázané ich synergické pôsobenie [13–15].

Replikačno‑ deficientné vírusové vektory

Pri replikačno‑ deficientných vírusových vektoroch sú gény zodpovedné za ich replikáciu odstránené, resp. vymenené za transgén, čo znamená, že sú schopné replikácie iba v špecializovaných pomocných bunkových líniách, ktoré tieto gény obsahujú. Medzi najviac využívané vírusové vektory patria replikačno‑ deficientné adenovírusové vektory, retrovírusové vektory a adeno‑asociované vírusové vektory, závislé na adenovíruse alebo herpes simplex víruse, ktorý umožní dokončiť ich životný cyklus. Taktiež sa používajú vektory odvodené od HSV‑ 1 a simian vírusu 40 (SV40) [8].

Replikačno‑ deficientné adenovírusové vektory

Adenovírus je neobalený vírus ikosaéd­rového tvaru s priemerom 60– 90 nm a lineárnou dvojvláknovou DNA o veľkosti 30– 40 kb [16,17]. Pri transkripcii sa ako prvý exprimuje gén E1A kódu­júci transaktivátor pre transkripciu skorých génov E1B, E2A, E2B, E3 a E4, rovnako spolu s E1B pôsobí pri bunkovej transformácii (obr. 1). Genómový región E2 kóduje proteíny potrebné pre DNA replikáciu: DNA polymerázu, DNA‑ viažúci proteín a prekurzor terminálneho proteínu. Genómový región E3 kóduje produkty na moduláciu bunkových receptorov. Genómový región E4 má regulačnú funkciu, blokuje skorú a spúšťa neskorú transkripciu. Taktiež obsahuje gény, ktoré sú zodpovedné za aktivovanie imunomodulátorov. Jadrové a kapsidové proteíny a cysteínové proteázy potrebné na proteolytické zostrihnutie terminálneho proteínu ako aj ďalšie štruktúrne proteíny sú exprimované zo spoločného hlavného neskorého promótoru [18].

Spomedzi viac než 50 rôznych sérotypov ľudských adenovírusov je pre génovú terapiu najviac využívaný sérotyp 5(Ad5). Pre človeka je málo patogénny, spôsobuje napr. mierne akútne respiračné infekcie. Aj napriek tomu majú Ad vektory dobrý bezpečnostný profil a môžu byť produkované vo veľkých množstvách, neintegrujú sa do bunkového genómu, majú vysokú transduktivitu in vivo a transdukujú deliace i nedeliace sa bunky [8,18]. V súvislosti s ich vývojom rozoznávame tri hlavné skupiny: tzv. adenovírusové vektory prvej a druhej generácie a „gutless“ vektory. Adenovírusové vektory prvej generácie sú založené na princípe delécie E1 a E3 regiónu. Keďže funkcia E1 regiónu je pre replikáciu vírusu nevyhnutná, musí byť zastúpená v bunkových líniách, napr. ľudských embryonálnych bunkách obličiek 293 (human embryonic kidney –  HEK 293) alebo ľudských embryonálnych retinoblastov 911 (human embryonic retinoblasts –  HER 911). Adenovírusové vektory druhej generácie obsahujú ďalšie delécie E2 a/ alebo E4 regiónu, čím znižujú alebo eliminujú expresiu vírusových proteínov, zlepšujú stálosť expresie transgénu a podľa niektorých štúdií znižujú imunitnú odpoveď organizmu [17]. Gutless vektory dokážu niesť až 36 kb DNA. Sú zbavené všetkých kódujúcich regiónov (okrem 5’ a 3’ ITRs a zbaľovacieho signálu Ψ) a na dokončenie svojho replikačného cyklu potrebujú pomocný adenovírus, ktorý nesie všetky kódujúce regióny. Preto sú nazývané aj helper‑ dependent adenoviruses. Zbaľovací signál pomocného adenovírusu je odstránený (napr. pomocou Cre loxP systému), čím sa zabráni vytvoreniu pomocných adenovírusových častíc [19].

Adenovírusový vektor prvej generácie pJM17 bol vyvinutý Frankom Grahamom v roku 1988 [20]. Má veľkosť 40,3 kb a obsahuje celú Ad5 DNA molekulu a pBRX inzert nesúci ampicilínovú a tetracyklínovú rezistenciu. Transgén sa včleňuje do E1 regiónu. Rekombinantné virióny sa vytvárajú homológnou rekombináciou po kotransfekcii tohto plazmidu s pomocným plazmidom obsahujúcim E1 región v bunkách HEK 293 [20].

Veľkým prelomom v manipulácii Ad vektorov bol systém AdEasy1. Je založený na umelom bakteriálnom chromozóme (BAC), odvodený od Ad5 s deléciou E1 a E3 regiónov. Na včlenenie transgénu sa využíva homológna rekombinácia s pomocným plazmidom nesúcim transgén v baktériách E. coli. Veľkosť transgénu je do 10 kb, pričom je možné produkovať viacero transgénov z jedného vektora. Prítomnosť génu pre rezistenciu na antibio­tikum kanamycín zabezpečuje ľahkú identifikáciu rekombinantov (BAC s transgénom). Rekombinantné BAC sú linearizované pridaním enzýmu PmeI a následne vnesené do adenovírusových pomocných buniek HER 911 alebo HEK 293, ktoré obsahujú E1 región umožňujúci replikáciu vírusu. Vektor môže obsahovať zelený fluo­rescenčný proteín (green fluorescent protein –  GFP), čo dovoľuje priamu kontrolu efektivity infekcie [21].

Oveľa jednoduchší a modernejší je adenovírusový systém AdZ (Ad with zero clonning steps –  adenovírusový vektor bez klonovacích krokov). Bol vyvinutý neskôr než AdEasy1 a v porovnaní s týmto systémom obsahuje viacero vylepšení. AdZ je vektor odvodený od Ad5 s deléciou E1 a E3 regiónov, vložený v umelom jednokópiovom BAC v baktériách E. coli (kmeň SW102), čo umožňuje priame vloženie transgénu (ako PCR fragment) do buniek E. coli, teda bez pomocného plazmidu. Rekombinácia prebieha na základe teplotne-kontrolovaného λ fágového systému. Tento systém obsahuje endonukleázu I‑ SceI, ktorá zabezpečuje jeho linearizáciu po transfekcii do pomocných buniek. Transgény môžu byť exprimované v natívnej forme alebo so streptavidínovým V5 alebo GFP tagom. AdZ obsahuje aj tetracyklínový operátor, vďaka ktorému je možné umlčať expresiu transgénu [22].

Imunitná odpoveď na adenovírusové vektory

Mechanizmy prirodzenej imunity odpovedajú na vírusovú infekciu ako prvé. Adenovírusový kapsid interaguje so zložkami klasickej, alternatívnej a lektínovej komplementovej dráhy, čo má za následok aktiváciu komplementu v prítomnosti už existujúcich anti‑adenovírusových protilátok (po prekonanej infekcii spôsobenej adenovírusom), ako aj bez nich. U Ad séropozitívnych pa­cientov, ktorí prijímajú vysoké dávky Ad vektora, tak vzniká riziko silnej komplementovej aktivácie, ktorá môže viesť až k život ohrozujúcej systémovej odpovedi [23].

V skorej odpovedi prirodzenej imunity na infekciu zohrávajú doležitú úlohu toll like receptory (TLR) prítomné na povrchu mnohých imunitných buniek, vrátane dendritických buniek a makrofágov. Tieto molekuly rozpoznávajú vysoko konzervované mikrobiálne štruktúry pathogen‑associated molecular patterns (PAMPs), ako napr. peptidoglykán a lipopolisacharid. Adenovírusovo‑ asociované molekulárne motívy rozoznávajú receptory TLR2 a TLR9. Ich stimulácia iniciuje signálne dráhy MAPK a NF‑κ B vedúce k indukcii prozápalovej cytokínovej a chemokínovej odpovede. Medzi cytokíny a chemokíny exprimovené po podaní Ad vektorov patria interleukín (IL)-6, IL‑8, IL‑12, TNF‑α, interferón γ a λ, interferón inducibilný proteín 10, makrofágový zápalový proteín (MIP) 1β a MIP2 [24,25].

Infekcia buniek vírusmi, ale aj vírusovými vektormi spúšťa signálne dráhy indukujúce produkciu molekúl, ktoré aktivujú imunitný systém. Bunkové rozpoznávanie adenovírusu cez kapsidové komponenty je regulované pomocou týchto molekúl: coxackie-adenovirus receptor (CAR), membránový kofaktorový proteín (membrane cofactor protein) CD46, integríny a heparán sulfát – obsahujúce proteoglykány. Antivírusová vrodená imunitná odpoveď iniciovaná infikovanou bunkou aktivuje interferónovú odpoveď na zablokovanie vírusovej replikácie, pričom simultánne produkuje chemokíny na pritiahnutie neutrofilov a NK buniek [26].

Heterogénna populácia NK buniek je schopná rozoznať a usmrtiť predovšetkým nádorové a vírusmi infikované bunky. NK bunka na svojom povrchu exprimuje mozaiku inhibičných a aktivu­júcich receptorov. Príkladom je receptor NKG2D, ktorý rozoznáva min. 7 ligandov (príbuzné polypeptidové sekvencie k MHC triedy I). Tieto ligandy môžu byť nadexprimované u buniek vystavených stresu, napr. infekcii (vírusová, bakteriálna), tepelnému šoku alebo poškodeniu DNA [27]. Po ich rozpoznaní NK bunka spúšťa deštrukciu cieľovej bunky pomocou proteínov ako perforíny a granzýmy, ktoré sú prítomné v granulách v jej cytoplazme. Obsah granúl sa vyleje do priestoru synapsie medzi NK bunkou a cieľovou bunkou. Perforíny vytvárajú póry v membráne cieľovej bunky a granzýmy prechádzajú do vnútra cieľovej bunky, kde indukciou kaspáz iniciujú apoptotický proces. Tento jav bol popísaný aj v prípade infekcie adenovírusovými vektormi AdEasy1, kde bolo zistené zvýšenie expresie MICA antigénov (ligand pre NKG2D, príbuzná polypeptidová sekvencia k MHC triedy I) [27]. V prípade génovej terapie, ktorej cieľom je expresia transgénu, môže byť takýto scenár nežiadúci. Na zamedzenie tohto procesu sú vo vývoji adenovírusové vektory s ďalšími modifikáciami, ktorých úlohou je predísť aktivácii signálnych dráh vedúcich k aktivácii imunitného systému. Jednou z možností modifikácií je manipulovanie regiónom E4 namiesto jeho úplnej delécie, ktorá spôsobuje ťažkosti pri príprave vektorov druhej generácie a gutless vektorov, a tým obmedzuje ich použitie v praxi. Naopak manipulácia E4 regiónom má znížiť aktiváciu imunitného systému, pričom vitalita vírusu zostáva zachovaná.

Adaptívna imunitná odpoveď na vírusovú infekciu je spojená s T a B bunkami imunitného systému. Adenovírusovo špecifické T cytotoxické bunky (CD8+, CTLs) rozoznávajú vírusový antigén v komplexe s molekulou MHC class I na povrchu infikovanej bunky, čo vedie k uvoľneniu perforínu a následnej lýze infikovanej bunky. CD4+ pomocné T bunky sú aktivované vírusovým antigénom v komplexe s molekulou MHC class II na povrchu antigén prezentujúcich buniek. Po aktivácii začnú produkovať cytokíny a stimulovať proliferáciu B buniek [28].

B bunky zabezpečujú humorálnu odpoveď, čo je jeden z kľúčových komponentov imunitnej odpovede. Produkcia protilátok závisí od schopnosti B buniek rozpoznať špecifický epitop na cudzom antigéne. V súvislosti s humorálnou imunitnou odpoveďou je potrebné spomenúť, že ľudská populácia je vystavená adenovírusom a adeno‑asociovaným vírusom a väčšina ľudí má k týmto vírusom protilátky. Ich prítomnosť môže negatívne ovplyvniť úspešnosť génovej terapie založenej na adenovírusoch a adeno‑asociovaných vírusoch. Jedným zo spôsobov, ako sa vyhnúť už prítomným anti‑adenovírusovým protilátkam, je využitie alternatívnych sérotypov vírusu (namiesto sérotypu 5), ako napr. adenovírus 2 a 7. Taktiež sa vyvíjajú vektorové systémy s využitím zvieracích (psích, prasacích, šimpanzích) adenovírusov [29,30]. Tieto prístupy tiež riešia problém s pamäťovými B bunkami, u ktorých sa produkcia anti‑adenovírusových protilátok nedá zablokovať.

Adenovírusové vektory v klinických štúdiách

V roku 1993 podstúpil génovú terapiu pomocou Ad vektora prvý pa­cient. Odvtedy do roku 2012 bolo uskutočnených dokopy 438 klinických štúdií, v ktorých sa použili rôzne typy adenovírusových vektorov a 92 klinických štúdií, pri ktorých boli využité adeno‑asociované vektory [10,18].

Adenovírusové vektory môžu byť aplikované systémovo alebo lokálne v závislosti od účelu terapie. Podávané sú intravenózne, subkutánne alebo intradermálne, intramusklárne a tiež respiračnou cestou [31]. Pri klinických štúdiách je táto terapia celkovo dobre tolerovaná, medzi vedľajšie účinky použitia Ad vektorov patria mierna horúčka, lokálna bolesť, triaška a zimnica [32]. Avšak v roku 1999 18- ročný pa­cient s čiastočnou deficienciou ornitíntrans­kerbamylázy (OTC) zomrel po podaní veľmi vysokej dávky (3,8 × 10¹³ častíc) Ad vektora druhej generácie, ktorý niesol funkčný OTC gén. Príčinou jeho smrti bola Ad vektorom indukovaná prirodzená imunita, ktorá spôsobila akútne uvoľnenie zápalových mediátorov, čo viedlo k systémovému zápalu a multior­gánovému zlyhaniu [33]. Táto udalosť mala za následok reevaluáciu protokolov a sprísnenie podmienok na používanie Ad vektorov.

Podľa U.S. National Institutes of Health [34] je k 1. 3. 2015 v I. fáze klinických testov ukončených 49 štúdií s použitím adenovírusových vektorov, z ktorých 14 je zameraných na liečbu nádorových ochorení. V II. fáze je ukončených 18 štúdií, z ktorých deväť sa zaoberá liečbou rakovinových ochorení. V III. fáze je ukončená jedna štúdia za­oberajúca sa exprimovaním TNF‑α, ktorý je pod kontrolou chemoradiačne inducibilného promótora, v tkanivách vystavených radiácii pri rakovine pankreasu [5]. Novozačínajúcich štúdií (so statusom prijímajúci/ ešte neprijímajúci dobrovoľníkov) I. fázy je 19, z čoho v šiestich prípadoch sa jedná o génovú terapiu určenú na liečbu nádorových ochorení, novozačínajúcich štúdií II. fázy je deväť, pričom v piatich prípadoch ide o protinádorovú terapiu a v III. fáze je jedna novozačínajúca štúdia zameraná na liečbu nádorového ochorenia. Okrem využitia adenovírusových vektorov na liečbu nádorových ochorení sú vo vývoji a klinických skúškach aj adenovírusové vakcíny proti rôznym infekčným ochoreniam (HIV, ebola, malária, chrípka, tuberkulóza a i.) [34].

Záver

Génová terapia ponúka množstvo možností na liečbu nádorových ochorení. Využitie vírusových ako aj nevírusových systémov je efektívny spôsob na vnesenie genetického materiálu do buniek. Ďalšie štúdium vplyvov génovej terapie na organizmus a imunitný systém, najmä v prípade vírusových vektorov, nám dáva priestor na optimalizovanie jej účinkov a na ďalšie vylepšenia, vďaka ktorým by mohla byť rutinne používaná v klinickej praxi. V tejto súvislosti je nutné študovať vplyv vektorov na vnútrobunkové mechanizmy a následne zabezpečiť ich úpravu tak, aby sa minimalizovala imunitná odpoveď organizmu. U adenovírusových vektorov sa zdá byť sľubným postupom manipulácia regiónom E4, ktorý hrá dôležitú úlohu pri aktivácii imunomodulátorov. Ideálnym výsledkom tejto manipulácie by mal byť vektor, ktorý pri použití vyvoláva minimálnu imunitnú odpoveď organizmu a mohol by byť bežne používaný in vivo.

Práca bola podporená Európskym fondom pre regionálny rozvoj a štátnym rozpočtom Českej republiky (OP VaVpI – RECAMO CZ.1.05/2.1.00/03.0101), projektom MŠMT – NPU I – LO1413 a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Mariana Pjechová

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: mariana.pjechova@mou.cz

Obdržané: 2. 4. 2015

Prijaté: 20. 7. 2015