Histologická a histochemická analýza retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku u dětí

Souhrn

Cíle:
Histologická a histochemická analýza retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku u dětí. Identifikace morfologických abnormit v porovnání se strukturou zdravého ušního bubínku. Identifikace znaků typických pro cholesteatom a podpora retrakční teorie vzniku cholesteatomu.

Dizajn studie:
Prospektivní studie analyzující 31 chirurgicky odebraných retrakčních kapes. Pracoviště: Fakultní nemocnice, Pracoviště dětské medicíny.

Metody:
Vzorky retrakčních kapes zpracované standardním procesem pro účely světelné mikroskopie, obarveny hematoxylin - eozinem. K upřesnění pozorovaných nálezů byla použita barvení k průkazu kolagenního vaziva dle Van Giesona, k průkazu elastických vláken barvení dle Verhoeffa, k průkazu kyselých mukopolysacharidů barvení metodou Alcián a k průkazu polysacharidů v bazální membráně metoda PAS (Periodic Acid Schiff).

Výsledky:
Ve vzorcích retrakčních kapes jsme pozorovali následující nálezy: 1 hyperkeratóza (100%), 2 hypervaskularizace (100%), 3 subepiteliální fragmentovaná elastická vlákna (96%), 4 myxoidní změny (87%), 5 subepiteliální zánětlivý infiltrát (84%) 6 přítomnost rete pegs (71%), 7 papilomatóza (71%) 8 intraepiteliální zánětlivá celulizace (48%) 9 intraepiteliální spongióza (16%) a 10 parakeratóza (3%). Nepozorovali jsme poruchu kontinuity bazální membrány. Délka i tloušťka retrakční kapsy, tloušťka epidermis, výskyt rete pegs a četnost fragmentovaných elastických vláken byly větší ve skupině III než II.

Závěr:
Popsali jsme morfologické abnormity ve struktuře retrakční kapsy v porovnání se zdravým ušním bubínkem. Uvedené změny jsou typické pro strukturu cholesteatomu, podporují tak retrakční teorii jeho vzniku. Klíčovou roli v patogenezi retrakční kapsy sehrává dle pozorování zánět. Četnost některých změn vzrůstá se stadiem retrakční kapsy (II - III dle Charachona). Porucha kontinuity bazální membrány není pro retrakční kapsu typická.

Klíčová slova:
retrakční kapsa, histologická analýza, cholesteatom, dětský věk

ÚVOD

Retrakční kapsa ušního bubínku (RK) je lokalizovaná oblast bubínku vpáčená směrem do bubínkové dutiny. Na rozdíl od zdravého ušního bubínku, který je popsán jako relativně tuhá, elastická membrána bez tendence ke kolapsu, je RK poddajná a s tendencí ke kolapsu do dutiny bubínkové. RK je charakterizována oslabením části bubínku, ve které dochází k vtahování bubínku nejčastěji v oblasti kostěných anatomických struktur jako je incisura Rivini, scutum nebo kladívko (1). RK se může vyskytovat ve všech kvadrantech pars tensa bubínku, stejně tak může postihovat oblast pars flaccida. Může postihovat i obě části bubínku zároveň. RK vzniká v důsledku dlouhotrvajícího nebo recidivujícího podtlaku ve středním uchu, který je způsoben především dysfunkcí Eustachovy trubice (1, 2, 3, 4, 5, 6). Na druhé straně zde existují teorie a hypotézy, které tvrdí, že v patogenezi vzniku RK se uplatňuje přítomnost mesenchymu nebo zánětlivé reakce v návaznosti na otitidu ve středním uchu, především v zadním horním kvadrantu pars tensa a v oblasti pars flaccida, což jsou dvě místa typická pro vznik retrakční kapsy a atelektázy. Někteří autoři tvrdí, že bez zánětu retrakce nevzniká (7, 8). Tyto dvě lokality jsou obecně nejvíc poddajné oblasti ušního bubínku a jsou tedy nejvíce náklonné k invaginaci v přítomnosti podtlaku ve středouší.

Existuje několik málo histologických studií, které popisují poruchu kontinuity bazální membrány u cholesteatomu a které podporují retrakční teorii vzniku cholesteatomu a ještě méně prací, které popisují histologickou strukturu RK a případné znaky vedoucí ke vzniku cholesteatomu (10). Sadé zkoumal atelektatické ušní bubínky a pozoroval degeneraci prostřední pojivové vrstvy bubínku, ke které dle jeho názoru dochází v důsledku zánětlivého procesu zde probíhajícího (8, 9). Sudhoff a Tos ve svých pracích popisují poruchu kontinuity bazální membrány cholesteatomu. Tyto disrupce bazální membrány jsou lokalizované v oblastech prorůstajících epitelových čepů (rete pegs) a ložisek subepiteliálního zánětlivého infiltrátu (11, 12). Na základě těchto a dalších pozorování tito autoři podporují retrakční teorii vzniku cholesteatomu na podkladě mechanismu invaginace bubínku a následné proliferace epitelu, která způsobí hyperplazii, poruchu buněčné migrace a tvorbu a hromadění keratinu, čímž vzniká základ cholesteatomu. Jejich pozorování se týkala pouze cholesteatomu a dodnes existuje velmi málo prací studujících v této souvislosti přímo retrakční kapsu jako možný prekurzor cholesteatomu.

Naše studie prezentuje histologickou a histochemickou analýzu retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku (RK) u dětí. Popisuje morfologické abnormity RK v porovnání se strukturou zdravého ušního bubínku a znaky typické pro cholesteatom. Zároveň se snaží potvrdit nebo vyvrátit hypotézu, že dochází k poruše kontinuity bazální membrány RK.

METODY

Prospektivní studie, ve které bylo histologicky vyšetřeno 31 RK pars tensa ušního bubínku odebraných během standardních plánovaných operacích u dětských pacientů. Jednalo se o RK stadia II a III dle Charachona, bez známek progrese cholesteatomu. Indikace k operačnímu řešení RK byly: nedoslýchavost v souvislosti s RK, nebo otomikroskopicky sledována progrese onemocnění. Ze studie byly vyloučeny případy RK s klinickými znaky cholesteatomu a RK, které nebylo možno odstranit vcelku. Ve všech případech následovala po odstranění RK rekonstrukce bubínku chondroperichondriovým štěpem z tragu.

Všichni pacienti podstoupili předoperační vyšetření zahrnující odebrání anamnézy, otomikroskopické vyšetření, tympanometrické výšetření a audiometrické vyšetření sluchu (tónová audiometrie).

RK byly rozděleny do 2 skupin dle klasifikace dle Charachona (II – RK kontrolovatelná, fixovaná, III – RP nekontrolovatelná, fixovaná). RK stadia I (kontrolovatelná a nefixovaná) standardně neoperujeme.

Všechny vzorky byly ihned po odběru orientovány a vloženy na pruh molitanového fixačního materiálu a vloženy do histologické komůrky, vždy tak, aby zevní (zvukovodová) strana byla nahoře a vnitřní (středoušní) strana dole v bloku. Následně byly vzorky vloženy do 4% pufrovaného formalínu. Po dostatečné fixaci (24–48 hodin) bylo provedeno přikrojení na bloky maximální tloušťky 5 mm. Fragmenty byly zpravidla rozpůleny a postaveny na linii řezu. Všechny takto zhotovené tkáňové bloky byly odvodněny a zpracovány v odvodňovacím automatu Tissue - Tek® VIP® 6 Vacuum Infiltration Processor (Sakura). Po zalití do parafínu byly připraveny řezy o tloušťce 3 μm. Všechny řezy byly barveny základním histologickým barvením hematoxylin - eozin. K upřesnění pozorovaných nálezů byla použita barvení k průkazu kolagenního vaziva dle Van Giesona, k průkazu elastických vláken barvení dle Verhoeffa, k průkazu kyselých mukopolysacharidů barvení metodou Alcián a k průkazu polysacharidů v bazální membráně metoda PAS (Periodic Acid Schiff). Z odebraných vzorků bylo zpracováno celkem 31 parafínových bloků a preparátů barvených HE a po 31 preparátech barvených metodou Alcián, PAS, Van Giesson a elastika. Hodnocení bylo prováděno v optickém mikroskopu Olympus BX 45 při zvětšení 100x a 200x, High Power Field 400x. Hodnocení histologických preparátů probíhalo ve spolupráci 2 patologů. Tloušťka epitelu byla měřena v 10 různých místech a následně byl spočítán průměr.

VÝSLEDKY

Průměrná délka vzorku byla 4955,4 µm. Pozorovali jsme, že délka RK ve skupině III je větší než ve skupině II (p=0,01293, two sample T-test). Průměrná tloušťka vzorku byla 333,5 µm. Po odstranění 2 extrémních hodnot je tloušťka vzorku ve skupině III větší než ve skupině II (p=0,001005, two sample T-test).

Epidermis: zevní epitelová vrstva. Zevní epitelová vrstva ušního bubínku tvořena mnohovrstevným dlaždicovým rohovějícím epitelem byla přítomna u všech 31 vzorků. Průměrná tloušťka epidermis byla 46,3 µm. Pozorovali jsme změnu tloušťky epidermis mezi stadiem II a III, průměrná tloušťka ve skupině stadia II byla 35,1 µm, ve skupině stadia III 54,4 µm, jedná se tedy o statisticky významný rozdíl v tloušťce epidermis (p=0,001469, two sample T-test). Zvýšená keratinizace (hyperkeratóza) zevní vrstvy bubínku byla přítomna u všech 31 vzorků RK (obr. 1). Sledovali jsme 2 typy hyperkeratózy – lamelární a basket. Lamelární hyperkeratóza se vyskytovala ve všech vzorcích, basket hyperkeratóza v 26 vzorcích. Parakeratózu (jádra v zrohovatělé vrstvě, co svědčí o rychlém obratu buněk) jsme identifikovali pouze v 1 případě.

Epidermis: vnitřní bazální vrstva. Pozorovali jsme prorůstání mnohovrstevného dlaždicového rohovějícího epitelu (epidermis) ve formě epitelových čepů - rete pegs (obr. 2) směrem do prostřední vrstvy bubínku, a to ve 22 případech. Tyto epitelové čepy se mnohem častěji vyskytovaly u RK stadia III (18 z 18 pacientů) než u stadia II (4 z 13) pacientů (p=3,547e-05, Fischer exact test).

Bazální membrána. K identifikaci bazální membrány jsme použili metodu PAS. V žádném vzorku RK jsme nepozorovali poruchu kontinuity bazální membrány (obr. 3).

Prostřední vazivová vrstva. V 27 případech jsme pozorovali narušení dvojité vrstvy kolagenních vláken a její prosáknutí neutrálními mukosubstancemi (myxoidní změny). Pouze ve 4 případech byla dvojitá vrstva kolagenních vláken dobře diferencovaná. V žádném případě jsme nepozorovali úplné chybění lamina propria. Nebyl statisticky významný rozdíl ve výskytu myxoidních změn mezi stadiem II a III. Dále byla přítomna hypervaskularizace prostřední vrstvy ve všech 31 vzorcích, v 21 % se jednalo o nezralé kapiláry (obr. 4). Ve všech případech jsme nalezli subepiteliálně elastická vlákna, a to jak kontinuální tak fragmentovaná (obr. 5). Fragmentovaná elastická vlákna jsme dle četnosti hodnotili jako + a ++, přičemž mnohem četnější byly ve skupině III (p=0,01699, Fis­cher exact test). Intraepiteliální spongióza (intracelulární edém) byla přítomna v 15 případech. Pozorovali jsme rozdíl v četnosti mezi skupinou II (30 %) a III (55 %). Subepiteliální chronický zánětlivý infiltrát byl přítomen v 26 z 31 vzorků a obsahoval převážně lymfocyty, histiocyty a plazmatické buňky, ojediněle eozinofily (obr. 2, obr. 4). Nebyl pozorován rozdíl v četnosti výskytu mezi jednotlivými stádii RK. Detailní popis pozorovaných abnormit v závislosti na stupni RK poskytují tabulky 1 a 2.

Délka i tloušťka retrakční kapsy, tloušťka epidermis, výskyt rete pegs a četnost fragmentovaných elastických vláken byly větší ve skupině III než II.

Vnitřní slizniční vrstva. Vnitřní slizniční vrstva nebyla přítomna v 13 z 31 vzorků. Tento jev je podobný vzhledu cholesteatomu, kdy jsou nahromaděné vrstvy epitelu postupně obklopeny perimatrix tvořenou pojivovou tkání se zánětlivým infiltrátem a není zde žádná další vrstva.

DISKUSE

Práce popisuje histologickou strukturu retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku u dětí. Poukazuje na výskyt znaků typických pro strukturu cholesteatomu. Některé z těchto znaků se vyskytují s vyšší frekvencí a ve větším rozsahu u vyššího stupně RK, což podporuje tvrzení, že RK je precholesteatomové stadium. Hlavní histologické nálezy představují hyperkeratóza, hypervaskularizace, subepiteliální fragmentovaná elastická vlákna, myxoidní změny, subepiteliální zánětlivý infiltrát, přítomnost rete pegs a papilomatóza. V 27 případech jsme pozorovali narušení dvojité vrstvy kolagenních vláken (myxoidní změny). Vnitřní slizniční vrstva nebyla přítomna v 13 z 31 vzorků. Nepozorovali jsme poruchu kontinuity bazální membrány při použití metody PAS, co nás nepřekvapilo, protože porucha kontinuity bazální membrány je typická spíše pro malignity, zatímco RK a cholesteatom jsou léze benigní. Délka i tloušťka retrakční kapsy, tloušťka epidermis a výskyt rete pegs byly větší ve skupině III než II. Větší tloušťku RK ve skupině III připisujeme zvýšené proliferaci epidermis a narušení prostřední vrstvy bubínku, kdy dojde k oslabení dvojité vrstvy kolagenních vláken a k poruše struktury elastických vláken.

Ve většině prací je za hlavní etiologický faktor vzniku RK považován dlouhodobý podtlak ve středním uchu způsobený dysfunkcí sluchové trubice (1, 2, 3, 4, 5, 6). Několik málo studií poukazuje na fakt, že ke vzniku retrakce nestačí pouze samotná přítomnost podtlaku (5, 13). Někteří autoři považují za důležitý faktor vedoucí ke vzniku retrakce bubínku poškození prostřední kolagenové vrstvy, ke kterému dochází působením zánětu (9, 8, 13).

V naší studii byl subepiteliální chronický zánětlivý infiltrát přítomen v 26 z 31 vzorků a v 27 případech jsme pozorovali narušení dvojité vrstvy kolagenních vláken a její prosáknutí neutrálními mukosubstancemi (myxoidní změny). Lamina propria je tvořena komplexem kolagenních i elastických vláken a právě elastické vlákna ovlivňují pružnost a poddajnost bubínku (15). Četnost fragmentovaných elastických vláken byla vyšší u stadia III. Pouze ve 4 případech byla dvojitá vrst­va kolagenních vláken dobře diferencovaná, dle některých autorů se může jednat o reverzibilní RK, které by se mohly upravit do normální polohy po adekvátní terapii, například po zavedení tlak vyrovnávající trubičky (10). Myslíme si, že fragmentace elastických vláken a narušení kolagenní dvojité vrstvy významným způsobem narušuje strukturu bubínku a činí ho náchylnějším k působení podtlaku ve středním uchu.

Některé studie popisují u cholesteatomu epitelové čepy prorůstající do perimatrix (11, 12). Tyto oblasti obsahují vyšší počet proliferujících buněk. Takové čepy (rete pegs) jsme s vysokou frekvencí pozorovali v našich vzorcích (22 z 31 pacientů) a byly mnohem četnější u stadia III. Dle našeho názoru se jedná o jeden ze znaků základu cholesteatomu.

Četnost a rozsah některých pozorovaných znaků roste se stupněm klinické závažnosti retrakční kapsy. Hyperkeratóza, papilomatóza, intraepiteliální spongióza a subepiteliální zánětlivý infiltrát se vyskytovaly u obou stadií rovnoměrně. Parakeratózu jsme zaznamenali pouze v 1 případě. Délka i tloušťka retrakční kapsy, tloušťka epidermis a výskyt rete pegs byly větší ve skupině III než II, zvyšoval se i podíl fragmentovaných elastických vláken. S vyšším stadiem RK tedy dochází k degeneraci prostřední vrstvy bubínku, ke zvětšování tloušťky epidermis a tvorbě epitelových čepů, bazální membrána zůstává intaktní, jedná se o známky typické pro vývoj cholesteatomu. Vzrůstající výskyt těchto histologických znaků v souvislosti s klinickou progresí RK (II -III) svědčí o tom, že RK je prekurzorem pro vznik cholesteatomu.

Studie podporuje retrakční teorii vzniku cholesteatomu v dětském věku. Poskytuje důkazy, že na vzniku RK se podílí nejenom podtlak ve středním uchu, ale že klíčovou roli sehrává působení zánětu a oslabení a destrukce prostřední vrstvy bubínku, čímž se bubínek stává k podtlaku náchylnější.

ZÁVĚR

V současnosti existuje omezený počet prací zabývajících se histologickou analýzou retrakční kapsy pars tensa ušního bubínku a jejího vztahu k cholesteatomu v dětském věku. Tato práce navazuje a podporuje některé práce předešlé. Popsali jsme histologické znaky jako je hyperkeratóza, prorůstající epitelové čepy, subepiteliální zánětlivý infiltrát, hypervaskularizaci a degenerativní změny prostřední vrstvy bubínku s přítomností fragmentovaných elastických vláken s vysokou četností. Délka i tloušťka retrakční kapsy, tloušťka epidermis a výskyt rete pegs byly větší ve skupině III než II, zvyšoval se i podíl fragmentovaných elastických vláken. Svědčí to o faktu, že v případě RK se jedná o progresivní onemocnění, vedoucí ke vzniku cholesteatomu. Uvedené nálezy podporují i naše rozhodování o včasném operačním řešení RK pars tensa ušního bubínku, obzvláště stadia III dle Charachona. Naopak jsme na rozdíl od některých autorů nepozorovali poruchu kontinuity bazální membrány. Na základě našich pozorování považujeme retrakční kapsu pars tensa ušního bubínku u dětí za precholesteatomové stadium.

Podpořeno projektem: MUNI/A/1266/2015.

Adresa ke korespondenci:

MUDr. Milan Urík

Klinika dětské ORL LF MU a FN

Černopolní 9

613 00 Brno

e-mail: docttor.urik@gmail.com