Identifikácia markerov proliferačnej aktivity v karcinóme endometria

Souhrn

Endometrium je špecializované tkanivo, ktorého morfologický vzhľad –  ako aj prítomnosť mnohých proteínov v ňom –  sa ne ustále mení v priebehu biologického veku ženy, počas menštru ačného cyklu a výrazne v nádorových procesoch. Celkom 60 vo formalíne fixovaných a do parafínu zaliatych bioptických tkanivových vzoriek s proliferujúcim (PE, 10) a sekrečným (SE, 10) endometriom, endometrio idným G1 (ECG1, 10) a G3 (ECG3, 10), seróznym (SC, 10) a svetlobunkovým (SvC, 10) karci nómom endometria (CaE) sme vyšetrili imunohistochemicky (IHC) na expresiu pro‑teínu PCNA, Ki- 67 a p53 v jadrách epitelových buniek žliazok endometria. Expresia PCNA a Ki- 67 bola vysoká v PE, s výrazným poklesom v SE. V CaE expresia PCNA a Ki- 67 bola vysoká a zásadne sa nelíšila od expresie v PE a v jednotlivých histolo gických podtypoch a stupňoch CaE, pričom najvyššia expresia PCNA a Ki- 67 bola u agresívnych typov CaE. Expresia p53 mala vzťah len k agresívnemu (najmä SC a ECG3, zriedkavejšie SvC) typu CaE a k horšiemu klinickému priebehu nádorovej choroby. Súhrnne možno konštatovať, že proteíny p53, Ki- 67 a PCNA sú dôležitými znakmi prognózy vývoja CaE. Ich hodnotenie pomocou IHC je pomerne lacnou a jednoduchou metódou s implikáciou pre klinickú prax. V CaE s agresívnym fenoty pom (najmä v SC a ECG3, menej SvC) dochádza k vzostupu expresie p53. Expresia Ki- 67 a PCNA sú výborným markerom malígnej premeny buniek endometria naj mä po menopa uze, ktoré za normálnych okolností Ki- 67 a PCNA netvorí (tab. 1, obr. 8) [73].

Kľúčové slová:
karcinóm endometria –  proliferačné markery –  PCNA –  Ki- 67 –  p53 –  imunohistochémia –  prognostické faktory

Úvod

Výrazne stúpajúci výskyt zhubných nádorov tela maternice žien (American Cancer Society 2000, Jemal et al, 2005, Pleško et al, 1994, Pleško et al, 2003, Redecha et al, 2004) je predmetom záujmu mnohých odborníkov z rôznych vedných odborov. Sú to onkológovia, gynekológovia (Redecha et al, 1996, 2004, 2005, Šuška a Holomáň,1997, Šuška, 2003), molekuloví biológovia a genetici (Weismanová et al, 2002, Repiská et al, 2003, Molnárová et al, 2006), patológovia (Deligdisch a Cohen, 1985, Robboy et al, 1988, 2002, Danihel et al, 1995, 2002, 2003, 2005, Danihel a Breitenecker, 1997, Silverberg et al, 2003, Šišovský et al, 2004, 2006a, 2006b, 2006c, 2006d, 2006e, Šišovský, 2005, Gomolčák et al, 2005, Budaj a Bučeková, 2007a,b). K rozšíreniu poznatkov o tejto malignite výrazne prispievajú patológovia, najmä z hľadiska stanovenia presnej diagnózy.

Karcinóm endometria je najčastejšia invázna neoplázia ženského pohlavného traktu, 4. najčastejšie diagnostikovaný karcinóm v Spojených štátoch amerických a celosvetovo 5. najčastejší karcinóm u žien a má stúpajúci výskyt (American Cancer Society, 2000, Ronnett et al, 2002, Jemal et al, 2005). Vrátane Slovenska, kde ich počet vzrástol podľa Národného onkologického registra SR za posledných 20 rokov (1980 až 2000) takmer o tretinu (Pleško et al, 1994, 2003). Karcinóm endometria sa na Slovensku dotýka každoročne asi 700 žien, pričom asi 200 ich končí fatálne. Imunohistochemická analýza je veľakrát jedným z rozhodujúcich faktorov stanovenia diagnózy a prognózy nádorovej choroby a výrazne ovplyvňuje jej liečbu (Danihel a Porubský, 1991, Danihel et al, 1995, Azumi a Czernobilsky, 2002).

Endometrium je špecializované tkanivo, ktorého morfologický vzhľad, ako aj prítomnosť mnohých proteínov v ňom sa ne ustále mení (Mutter a Ferenczy, 2002). Mení sa v priebehu biologického veku ženy, počas menštru ačného cyklu (Mutter a Ferenczy, 2002) a výrazne v nádorových procesoch (Ronnett et al, 2002). Expresia niektorých proteínov môže byť prvotriednym indikátorom bunkovej diferenciácie, proliferácie a skorým znakom ich malígnej premeny.

Karcinóm endometria (CaE)

CaE pochádza zo žľazových epitelových štruktúr endometria. Má rozličné histopatologické formy (tab. 1). Každá z nich má vlastné špecifické morfologické vlastnosti. Podľa Robboya et al (1988) niektoré formy hyperplázie endometria (HE) a CaE tvoria široké spektrum proliferačných stavov, ktoré predstavujú morfologické a biologické kontinuum, začínajúce hyperpláziou žliaz endometria a končiace adenokarcinómom. Podľa Gusberga (1988) adenokarcinómu endometria možno predísť včasnou liečbou HE. Pozorovania iných dokazujú, že niektoré histologické podtypy (serózny podtyp) CaE nepochádzajú z HE (Ronnett et al, 2002, Silverberg et al, 2003, Danihel et al, 2005).

Patogenéza karcinómu endometria

Existujú snahy opísať prekancerózy CaE analogicky prekancerózam krčka maternice. Postupnosť patogenézy prekanceróz stúpa od jednoduchej HE (na karcinóm sa zmení u 1– 10 % žien o 2– 15 rokov) cez komplexnú HE (karcinóm vznikne u 12– 22 % žien za 1– 14 r.), atypickú komplexnú HE (progresia do karcinómu u 29– 100 % žien do 1– 5 rokov) a cez carcinoma in situ do CaE (Šuška, 2003).

CaE rastie pomerne pomaly. Zväčšuje rozmery tela maternice, potom má sklon k infiltrácii myometria a k rozpadu pre nekrózu (Zavadil a Motlík, 1984, Danihel et al, 2005). Aj malá a atrofická maternica môže ukrývať difúzne do myometria prenikajúci tumor (Wheeler et al, 2000). Má lepšiu prognózu než karcinóm krčka maternice, neskoro metastazuje (Poradovský, 1984). Neskôr sa CaE môže šíriť povrchovým rastom v endometriu, bežne do nižších segmentov maternice, aj do kanála krčka a do myometria (Ronnett et al, 2002, Redecha et al, 2005).

Početné epidemiologické, klinické, histopatologické a molekulovo- biologické a genetické štúdie z posledných rokov poukazujú na odlišnú patogenézu rôznych foriem tejto neoplázie. Predpokladajú sa dve základné formy CaE, typ I a typ II (Bokhman, 1983, Lax, 2004, Liu, 2007). S tým súvisí aj úzky vzťah veku žien k stupňu histologickej diferenciácie malignity, k hĺbke invázie a k rozsahu anatomického šírenia nádoru (Silverberg et al, 2003, Redecha et al, 2005, Liu, 2007).

Typ I CaE sa vyskytuje u mladších žien a žien v perimenopa uze. Je nižšieho malígneho potenciálu, býva dobre diferencovaný, invázia do myometria je často minimálna a invázia do lymfatických priestorov je zriedkavejšia. Vo všeobecnosti má dobrú prognózu. Často súvisí s hyperestrogenizmom a má estrogénové a progesterónové receptory (Lax, 2004). Vzniká v HE (Silverberg et al, 2003), z atypickej HE. Najčastejšou skorou genetickou poruchou je inaktivácia nádorového supresorového génu PTEN spôsobená mutáciou (Mutter et al, 2000), ďalej mutácia v „DNA mischmatch repair genes“ (MLH₁, MSH₂, MSH₆), mikrosatelitová instabilita a mutácia v K- ras a v b- catenin‑e (Lax, 2004). Typ I CaE reprezentuje endometrio idný histologický podtyp CaE (Bokhman, 1983).

Typ II CaE sa vyskytuje u starších žien. Je vyššieho malígneho potenciálu, býva menej diferencovaný, invázia a infiltrácia myometria je hlbšia alebo nádor prerastá a šíri sa do okolia tela maternice a má vyšší sklon k lymfogénnej propagácii (Robboy et al, 1988). Vo všeobecnosti má horšiu prognózu. V anamnéze nie sú dokázateľné vyššie uvedené endogénne rizikové faktory (Anderson et al, 2002), resp. nesúvisí s hyperestrogenizmom a nemá estrogénové a progesterónové receptory (Lax, 2004). Vzniká nezávisle od HE (Silverberg et al, 2003), v prostredí atrofie endometria, z intraepitelového CaE. Najčastejšia skorá genetická porucha je v nádorovom supresorovom géne TP53 (Deligdisch a Cohen, 1985, Lax, 2004), ďalej inaktivácii p16 a e- cadherin‑u, amplifikácia C- erbB- 2 (ERBB2) (Lax, 2004) a je prítomná ane uplo idia. Typ II CaE reprezentuje serózny histologický podtyp CaE (Bokhman, 1983).

V súčasnosti sa uvažuje aj o III. možnej forme CaE. Vo všeobecnosti s biologickými vlastnosťami a správaním sa nachádza niekde na rozmedzí medzi nádormi I. a II. typu. Nesúvisí s hyperestrogenizmom. Vzniká v prostredí atrofie endometria (Sivridis et al, 1988).

Bandera a Boyd (1977) navrhli aj IV. skupinu CaE. Vyskytuje sa u žien s vrodenou dispozíciou k vzniku karcinómu. Vzniká o 15 r. skôr než je všeobecne udávaná pre ostatnú populáciu. Má pomerne dobrú prognózu.

Klasifikácia karcinómu endometria

Modifikovanú verziu súčasnej klasifikácie CaE, na príprave ktorej sa podieľala Svetová zdravotnícka organizácia (WHO) a Medzinárodná spoločnosť gynekologických patológov (International Society of Gynecological Pathologists, ISGYP), uverejnili v AFIP (Armed Forces Institute of Pathology) Atlase nádorovej patológie (Silverberg a Kurman, 1992) a v mnohých odborných publikáciách (Scully et al, 1994, Breitenecker a Lax, 1994, Šuška a Holomáň, 1997, Danihel a Breitenecker, 1997, Šuška, 2003). Poslednú modifikovanú verziu tejto klasifikácie uverejnili v r. 2002 (Ronnett et al, 2002), s miernou úpravou v r. 2003 v klasifikácii WHO v Nádoroch prsníka a ženských pohlavných orgánov „Nádory tela maternice –  Epitelové nádory a príbuzné zmeny“ (Silverberg et al, 2003) (tab. 1).

Cieľ práce

Cieľom prezentovanej práce je identifikácia zmien expresie markerov proliferačnej aktivity v epitelových bunkách žliazok imunohistochemickými (IHC) metódami, v korelácii s morfologickým a klinickým nálezom pri CaE.

Materiál a metódy

Celkom 60 bioptických vzoriek endometria (z archívu Ústavu patologickej anatómie Lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave, r. 1994– 2004) z materníc (od žien vo veku 26– 86 r.) získaných hysterektómiou alebo kyretovaním endometria (pre krvácanie z maternice alebo nádor zistený sonografiou či výsledok predchádzajúcej biopsie) bolo zahrnutých v tejto štúdii. Vo formalíne fixované a do parafínu zaliate tkanivové vzorky s proliferujúcim (PE, 10×) a sekrečným (SE, 10×) endometriom (ženy vo veku 26– 45 r.), endometrio idným (EC) G1 (ECG1, 10×) a G3 (ECG3, 10×) (31– 61 r.), seróznym (SC, 10×) (39– 86 r.) a svetlobunkovým (SvC, 10×) (60– 86 r.) histologickým podtypom CaE sme vyšetrili IHC. Expresiu antigénu jadier proliferujúcich buniek (PCNA), antigénu Ki– 67 združeného s proliferáciou buniek (Ki- 67) a nádorového proteínu p53 (p53) v jadrách epitelových buniek žliazok endometria sme detegovali príslušnými monoklonovými protilátkami. Nepriamu metódu s komplexom streptavidínu a biotínu s chrenovou peroxidázou (ABC- Px) a s 3,3’- diaminobenzidínom ako chromogénom sme použili na vizu alizovanie re akčného produktu (DakoCytomation 2004, Azumi a Czernobilsky, 2002). Nálezy (re akciu protilátok/ expresiu proteínov) sme hodnotili svetelným mikroskopom (Nikon Eclipse E400, Tokyo, Japonsko) semikvantitatívne ako: negatívne –  0, nepravidelne slabo pozitívne (do 5 % buniek) –  0,5, pravidelne slabo pozitívne (> 5 % a  < 25 % buniek) –  1, pravidelne stredne silne pozitívne (25 % až 50 % buniek) –  2, pravidelne silne pozitívne (> 50% buniek) –  3. Použité postupy (výber materiálu do súboru) zodpovedali príslušným národným a medzinárodným etickým štandardom (revízia Helsinskej deklarácie z r. 2002) a pravidlám príslušných etických komisi í o právach pacienta (Jakubovský, 2003).

Výsledky

Výsledky hodnotenia expresie PCNA, Ki- 67 a p53 sú zhrnuté v grafe č. 1. Expresia PCNA (obr. 1) a Ki- 67 bola vysoká v PE s výrazným poklesom v SE. V CaE expresia PCNA bola vysoká a takmer rovnaká ako v PE (obr. 1) a zásadne sa v jednotlivých histologických podtypoch a stupňoch CaE nelíšila (obr. 3 a 4), pričom najvyššia miera expresie PCNA súvisela s agresívnym (SC, SvC a ECG3) (obr. 4) typom CaE. Najvyššia expresia Ki- 67 bola u agresívnych typov CaE (najmä SC a ECG3, menej SvC). Expresia p53 mala vzťah len k agresívnemu (najmä SC a ECG3, zriedkavejšie SvC) typu CaE (obr. 6, 7 a 8) a k horšiemu klinickému priebehu nádorovej choroby. V PE (obr. 2), v SE a v ECG1 (obr. 5) sme expresiu p53 nezistili.

Diskusia

Naše výsledky ukazujú dobrú koreláciu expresie vybraných proteínov s histologickým podtypom a stupňom diferencovania CaE a sú v zhode s inými publikovanými prácami, ktoré hodnotili validitu týchto znakov.

PCNA a Ki- 67 sú proteíny jadier buniek spojené s proliferáciou buniek. Ich expresia nie vždy navzájom koreluje (Azumi a Czernobilsky, 2002). Endometrium pred ovuláciou charakterizuje proliferácia buniek žliaz, strómy a endotelu ciev, maximálny počet buniek endometria syntetizujúcich jadrovú DNA, čo korešponduje s maximálnou aktivitou mitóz (Aronica a Katzenellenbogen, 1991) a s expresiou Ki- 67 (Tabibzadeh, 1990).

Hareyama (1994) opisuje v neskorej fáze PE signifikantne vyšší index PCNA (% jadier s obsahom PCNA) než v skorej fáze PE a než skorej a strednej fáze SE. Tieto nálezy sú podobné s našimi zisteniami, kde expresia PCNA a Ki- 67 v PE bola vysoká, ale v SE došlo k výraznému poklesu expresie PCNA a Ki- 67. Skoré a neskoré fázy PE, resp. SE sme samostatne nehodnotili.

Ito et al (1993) zistili, že v PE expresia PCNA bola signifikantne nižšia než v ECG3. Tieto nálezy sú odlišné od našich zistení, medzi PE a ECG3 sme nezistili žiadnu odlišnosť v expresii PCNA, kde expresia PCNA bola vysoká. Podobné výsledky má aj Hareyama (1994), ktorý v CaE tiež nezistil signifikantne vyšší index PCNA než v PE.

Elhafey et al (2001) tvrdia, že v EC expresia PCNA koreluje s jeho stupňom histologickej diferenciácie a je nižšia než v podtypoch CaE so zlou prognózou (SC a SvC). Chen et al (2001) zistili, že CaE so zlou diferenciáciou alebo v pokročilom klinickom štádiu majú vyššiu expresiu PCNA a sú agresívneho fenotypu, a že expresia PCNA spojená s expresiou ESR/ PGR (receptor pre estrogén/ receptor pre progesterón) má značnú hodnotu v ich prognóze. Tieto zistenia sú do určitej miery podobné s našimi výsledkami, ktoré ukazujú mierne stúpanie expresie PCNA so stupňom histologickej diferenciácie EC a najvyššiu expresiu PCNA v ECG3, v SC a v SvC. Expresiu ESR a PGR sme nezisťovali.

Yu et al (1993) tvrdia, že v CaE nie je jednoduchý vzťah medzi expresiou p53 a PCNA. Väčšina inváznych adenokarcinómov s expresiou p53, ale aj signifikantný počet CaE bez expresie p53 bolo s expresiou PCNA. Naše výsledky korešpondujú s uvedenými, v takmer všetkých CaE expresia PCNA bola výrazná, ale expresiu p53 sme nezistili v ECG1.

Výsledky Ito et al (1997) ukázali, že v SE je expresia Ki- 67 signifikantne nižšia než v PE a než v EC. Ich zistenia našli podporu v našich nálezoch, ktoré ukazujú vysokú expresiu Ki- 67 v PE a jej výrazný pokles v SE, kde bola výrazne nižšia než v ostatných nami sledovaných stavoch.

Ito et al (1997) ďalej v EC zistili signifikantne vyššiu expresiu Ki- 67 než v PE. Tieto nálezy naše zistenia potvrdili len čiastočne; expresia Ki- 67 v PE a v EC sa zásadne neodlišovala.

Lax et al (1998) sa domnievajú, že SC a SvC nezávisia od estrogénov a majú vysoký index Ki- 67 (% jadier obsahujúcich Ki- 67). Na rozdiel od SC, vo SvC zriedkavejšie dochádza k výraznej expresii p53. Preto usudzujú, že patogenéza SvC sa líši od patogenézy EC a SC. Tieto nálezy našli podporu v našich výsledkoch, ktoré ukázali v ECG3 a v SC najvyššiu expresiu Ki- 67, ale v ECG1 a v SvC expresia Ki- 67 bola mierne nižšia. Naše výsledky podporujú výsledky Salvesena et al (1998), ktorí hovoria, že v CaE expresia Ki- 67 koreluje s jeho histologickým podtypom a s FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics, FIGO) štádiom a že expresia Ki- 67 a štádium anatomického rozsahu tumoru zostáva významným nezávislým faktorom prognózy. Možno predpokladať, že mnohé znaky proliferácie sa objavia a budú mať dôležitú úlohu v prognóze jednotlivých typov CaE.

Kerns et al (1992) a Lodish et al (2004) tvrdia, že normálny (nemutovaný) typ p53 má krátky polčas životnosti a  v normálnych tkanivách sa nehromadí. Tvrdenia týchto a utorov podporujú naše zistenia, v PE a v SE sme expresiu p53 nezistili. Poškodený p53 (napr. mutáciou) má dlhší polčas životnosti, stráca tlmivú funkciu na proliferovanie a transformáciu buniek a hromadí sa v bunke, kde môže byť detegovaný IHC (Ronnett et al, 2002). Mutácie génu p53 (TP53) (Okamoto et al, 1991) a p53 sa nachádzajú približne u 10 % všetkých EC, asi v 50 % ECG3 a nie sú známe v ECG1 (Parazzini et al, 1995); tie sme našli ako zvýšenú expresiu p53 v ECG3, ale v ECG1 sa expresia p53 nevyskytla. Toto zistenie sa zhoduje s postavením, ktoré má p53 v progresii, ale nie v iniciovaní EC (Ronnett et al, 2002, Robboy et al, 1988, 2002).

V porovnaní s EC sa relatívne málo vie o SC na molekulovej úrovni. V SC nastáva štatisticky významná porucha génu TP53 v takmer 90 % prípadov. Okrem toho, asi 75 % vnútroepitelových CaE, údajného prekurzora SC, má mutácie TP53 (p53) (Tashiro et al, 1997). Tieto zistenia naznačujú, že v SC sa mutácie TP53 (p53) objavujú relatívne skoro a sú ústredné vo vývine tohto typu tumoru. Na rozdiel od EC, v ktorom TP53 (p53) mutácie sú pomerne nezvyčajné a keď sa vyskytnú, sú hlavne v ECG3 (Parazzini et al, 1995, Tashiro et al, 1997). Tento nález našiel podporu v našich výsledkoch; v SC došlo k najvyššiemu vzostupu expresie p53, o niečo slabšia expresia p53 bola v ECG3. Je teda možné, že mutácia TP53 je dôležitým faktorom v patogenéze SC a zodpovedá za jeho agresívne správanie (So ong et al, 1996). Skutočnosť, že mutácie TP53 (p53) sa vyskytujú najčastejšie v ECG3 a v SC, podporuje teóriu, že ide o nezávislý znak tumorov, ktoré sa správajú agresívne (So ong et al, 1996).

SvC sa správa podobne ako SC (Danihel a Breitenecker, 1997) oproti EC (Sakuragi et al, 2000). Napriek tomu je SvC pravdepodobne odlišný (patogenézou od patogenézy EC aj) od SC na základe významne zriedkavejšej IHC dokázanej expresii p53 (Lax et al, 1998). Táto zmena korešponduje s výsledkom našej analýzy, ktorá ukázala v SvC nižšiu expresiu p53 než v SC.

Elhafey et al (2001) sledovali expresiu PCNA a p53 v PE aj v SE, v EC, v SC a v SvC. Tvrdia, že expresia p53 v EC koreluje so stupňom histologickej diferenciácie CaE a je nižšia než v agresívnych (SC a SvC) podtypoch CaE. Expresia PCNA je podobná expresii p53 v rôznych podtypoch CaE a v EC stupňu histologickej diferenciácie. Naše výsledky ukázali vysokú expresiu p53 v SC, nižšiu v ECG3 a najnižšiu v SvC. Expresia PCNA však bola v týchto troch stavoch silná a rovnaká. Expresia PCNA v SE bola najnižšia zo všetkých nami sledovaných stavov endometria.

Ioffe at al (1998) korelovali expresiu faktorov proliferácie, apoptózy a p53 v PE a v ECG1. Frakciu proliferujúcich buniek (FPB) sledovali pomocou indexu mitóz (MI) a Ki- 67 indexom a sledovali apoptotický index (AI). Zistili, že: MI bol 2,48 % v PE a 0,91 % v CaE. Ki- 67 index bol 38,44 % a 31,7 %. AI bol 1,17 % a 3,31 %. Pomer AI/ MI a AI/ Ki- 67 bol najnižší v PE. V PE expresiu p53 nezistili. V CaE bolo 50 % s expresiou p53. CaE s expresiou p53 malo významne vyšší AI. Usudzujú, že v aktívne proliferujúcich tkanivách, akým je endometrium, FPB nekoreluje s progresiou do malignity. Lepším ukazovateľom progresie sú AI a pomer AI/ FPB. V CaE má expresia p53 vzťah k vysokej FPB a AI.

Expresia p53 a PCNA má hodnotu v prognóze pri CaE (Hamel et al, 1996), pričom p53 je nezávislým faktorom prognózy (So ong et al, 1996). Mutácia a overexpresia p53 v CaE sa všeobecne radia k agresívnemu (najmä SC) typu buniek, k vyššiemu stupňu histologického diferencovania, k hĺbke invázie do myometria a k vyššiemu FIGO štádiu CaE (napr. Khalifa et al, 1994, Lax et al, 1998, Tashiro et al, 1997, Geisler et al, 1996).

Záver

Súhrnne možno konštatovať, že proteíny p53, Ki- 67 a PCNA sú dôležitými znakmi prognózy vývoja CaE. Ich hodnotenie pomocou IHC je pomerne lacnou a jednoduchou metódou s implikáciou pre klinickú prax. S výrazným dopadom na liečbu CaE. Tá, v prípade už rozvinutej malígnej nádorovej choroby, je mimoriadne náročná, či z hľadiska finančného, osobného alebo spoločenského. V CaE s agresívnym fenotypom (najmä v SC a ECG3, menej SvC) dochádza k vzostupu expresie p53. Expresia Ki- 67 a PCNA sú výborným markerom malígnej premeny buniek endometria najmä po menopa uze, ktoré za normálnych okolností Ki- 67 a PCNA netvorí.

Poďakovanie

Táto štúdia bola re alizovaná s podporou (finančným darom) Lions Club International LC Bamberg- Mischelsberg a LC Kremnica a čiastočne grantu UK/ 36/ 2007. Autori ďakujú za technickú spoluprácu laborantkám p. I. Uhnavej, p. V. Chmelíkovej a p. L. Donarovej. Prvý a utor ďakuje za podporu Guvernérovi 2006– 2007 Lions Club International District D- 122 Česká republika a Slovenská republika p. dipl. Ing. Tiborovi Bučekovi.

MUDr. Vladimír Šišovský, PhD.

prof. MUDr. Ľudovít Danihel, PhD.

prof. MUDr. Pavel Babál, CSc.

MUDr. Michal Palkovič, PhD.

prof. MUDr. Ján Jakubovský, DrSc.

MUDr. Beata Bučeková

Miroslav Budaj

MUDr. Alžbeta Molnárová¹

Ústav patologickej anatómie Lekárskej fakulty Univerzity Komenského, Bratislava

¹ Oddelenie brachyterapie Kliniky radiačnej onkológie Onkologického ústavu sv. Alžbety, Bratislava