Krevní destičky v patogenezia léčbě solidních nádorů

Súhrn

Krevní destičky v patogenezi a léčbě solidních nádorů. Nádorové buňky spouštějí agregaci krevních destiček. Agregace trombocytů zase přispívá k růstu nádoru a tvorbě metastáz. Na úrovni mikroprostředí tumoru regulují krevní destičky nádorový růst prostřednictvím různých mechanismů, jež souvisejí se stimulací angiogeneze, zánětu, koagulace a stabilizace cévní stěny. V krevním řečišti jsou nádorové buňky obalené trombocyty chráněny před mechanickými třecími silami a před imunitní obranou, což umožňuje tvorbu vzdálených metastáz. Krevní destičky také napomáhají adhezi nádorových buněk a založení metastatického niche. Destičkové mikropartikule obsahují růstové faktory přispívající k nádorové angiogenezi. Trombocyty však mohou selektivně uvolňovat také anti-angiogenní faktory a tento jev se uplatňuje například u maligních nádorů ve stadiu dormance. Terapeutická inhibice agregace krevních destiček přispívá k částečné prevenci vzniku určitých typů nádorů a může vést také k příznivějšímu průběhu onemocnění.

Klíčová slova:
krevní destičky – nádory – angiogeneze – agregace destiček – inhibitory agregace destiček – nádorové mikroprostředí – aspirin – koagulace

ÚVOD

V posledních letech se potvrzuje úloha krevních destiček při progresi nádorových onemocnění (1). Již v šedesátých letech 19. století byla popsána agregace trombocytů navozená nádorovými buňkami, která je částečně odpovědná za protrombotické působení nádoru (2). Později bylo demonstrováno, že blokací tvorby agregátů destiček s nádorovými buňkami dojde k inhibici tvorby metastáz (3, 4) a že schopnost nádorových buněk aktivovat krevní destičky koreluje s metastatickým potenciálem nádorových buněk (5, 6).

Rozvoj poznatků o vztahu trombocytů a malignit je v posledních letech dán především faktem, že anti-angiogenní protinádorová terapie je často založená na inhibici VEGF a že destičky jsou hlavními transportéry VEGF; více než 80 % sérového VEGF se nachází v krevních destičkách (7, 8). Obecně se působení trombocytů považuje za pro-angiogenní a podporující růst a šíření nádoru. Nicméně destičky obsahují také anti-angiogenní faktory (9) a jejich funkční efekt na inhibici nádorové neovaskularizace byl popsán na myším modelu (10). Cílem této práce je podat přehled o vztahu nádorových onemocnění a hyperkoagulace, mechanismech agregace trombocytů indukované nádorovými buňkami a úloze destiček v mikroprostředí nádoru s důrazem na nádorovou angiogenezi.

NÁDOROVÁ ONEMOCNĚNÍ, TROMBOCYTY A HYPERKOAGULACE: KLINICKÁ POZOROVÁNÍ

Zvýšený výskyt tromboembolických příhod u pacientů s maligním onemocněním je v dnešní době všeobecně známý (11, 12). Protromboticky působí nejen protinádorová terapie, ale i nádor samotný a za jednu z příčin tromboembolie u onkologických pacientů je považována trombocytóza. Zvýšený počet krevních destiček u pacientů s malignitou byl popsán již v roce 1872 (13). Později byla trombocytóza popsána u karcinomu kolorekta, plic, prsu, žaludku, ledvin a u gynekologických malignit (ovarium, endometrium, cervix) jako negativní prognostický faktor (1, 14–20). Nádorové buňky a nádorové stroma (včetně krevních destiček) uvolňují řadu prozánětlivých cytokinů (IL-1, IL-6) a růstových faktorů (GM-CSF, G-CSF, VEGF), které stimulují proliferaci a zrání megakaryocytů, a tím přispívají ke zvýšenému počtu trombocytů v cirkulaci (21–26). Po odstranění nádoru klesá hladina krevních destiček, což potvrzuje, že nádor sám produkuje látky stimulující produkci destiček (1, 27). Prozánětlivé působení nádorového mikroprostředí vede ke zvýšení hladin reaktantů akutní fáze např. fibrinogenu (28), což dále usnadňuje vznik trombů. Na lokální úrovni nádoru přispívá zásadně k tromboembolii tzv. nádorem indukovaná agregace destiček (TCIPA, tumor cell-induced platelet aggregation) (3), které bude věnována následující kapitola. Protrombotické působení nádoru pak vede ke zvýšeným hladinám fibrin-degradačních produktů; např. u metastatického karcinomu prsu byla popsána asociace mezi zvýšenou hladinou D-dimerů, objemem nádoru a horší prognózou onemocnění (29) a byl popsán případ, kdy došetřování příčiny zvýšené hladiny D-dimerů u asymptomatické pacientky vedlo po vyloučení trombózy, zánětu, traumatu k detekci okultního kolorektálního karcinomu (30).

Pokusem na trombocytopenických myších s nádorem bylo odhaleno, že vlivem nedostatečného počtu krevních destiček dochází k poklesu proliferační aktivity nádorových buněk. Na tomto myším modelu byl také pozorován větší rozsah nekrózy nádoru v bezprostřední blízkosti místa krvácení v nádoru. Z toho vyplývá, že intratumorální krvácení je pro nádorové buňky nepříznivé a je potlačeno lokální degranulací destiček (31). Pozitivní vliv trombocytů na progresi nádoru byl prokázán působením acelulární frakce trombocytů na nádorové buněčné linie a na růst nádorů in vivo, kdy bylo potvrzeno, že růstové faktory uvolňované z krevních destiček podporují nádorovou angiogenezi, invazi nádoru a zhoršují prognózu. Bylo prokázáno, že VEGF je pro migraci buněk pankreatické nádorové buněčné linie důležitým, ale nikoliv jediným, faktorem (32).

MECHANISMY NÁDOREM INDUKOVANÉ AGREGACE TROMBOCYTŮ

Agregace trombocytů může být navozena řadou způsobů (obr. 1), z nichž se většina uplatňuje také v aktivaci krevních destiček navozené nádorovými buňkami:

ADP – adenosindifosfát. In vitro byla schopnost produkovat ADP vedoucí ke vzniku trombocytárních agregátů popsána u buněčné linie MCF-7 (karcinom prsu) (36, 37), Caco-2 (kolorektální adenokarcinom) (38) a dalších (39).

Trombin – hraje v procesu hemostázy dvě zásadní role: 1. vede k přeměně solubilního figrinogenu na vláknitý fibrin a 2. vazbou na receptory PAR-1 a PAR-4 na povrchu destiček stimuluje jejich aktivaci. Schopnost produkovat trombin a aktivovat agregaci trombocytů byla popsána u různých typů nádorových buněk in vitro (39, 40). Nádorové buňky dále přispívají ke vzniku trombinu produkcí proteinázy EC 3.4.22.26 (41, 42) zvané „cancer procoagulant“ – nádorový prokoagulant, která vede k přeměně faktoru X na FXa štěpící protrombin na trombin.

Matrixové metaloproteinázy (MMPs) – jsou proteolytické enzymy, jejichž hlavním cílem jsou složky extracelulární matrix (43). MMP-2 má schopnost stimulovat agregaci krevních destiček (44). Aktivace MMP-2 nádorovými buňkami vedoucí k TCIPA byla popsána in vitro u několika buněčných modelů (36, 45) a tento poznatek byl podpořen pozorováním zvýšené aktivace trombocytů závislé na MMP 2 u pacientů s metastatickým karcinomem prostaty (46).

Katepsin B. Schopnost agregovat destičky prostřednictvím produkce proteináz katepsinu B a katepsinu B podobné (cathepsin B-like) byla popsána in vitro (47, 48).

GPIIb/IIIa (tj. αIIbβ3). Existuje interakce mezi nádorovými buňkami a trombocyty zprostředkovaná re-ceptorem GPIIb/IIIa, jež vede k TCIPA (49) a přispívá k nádorové angiogenezi (50, 51).

Tkáňový faktor (TF). Zdrojem TF v nádorovém mikroprostředí jsou buňky stromatu, tj. fibroblasty, monocyty/makrofágy, buňky endotelu, ale také nádorové buňky (52–54). Velmi vysoká exprese TF u metastatických buněk v porovnání s primárním ložiskem u melanomu je pravděpodobně spojena s metastatickým potenciálem těchto buněk (55). Hladina TF u nádorových buněk negativně koreluje s prognózou onemocnění a pozitivně s hyperkoagulací (56–58). V experimentech vedla inhibice nebo snížená exprese tkáňového faktoru u nádorových buněk k redukci metastazování (55, 56, 59–61).

P-selektin je adhezní molekula, která má význam v angiogenezi založené na krevních destičkách. Je syntetizován a skladován v endotelových buňkách a α-granulích destiček. Po vyloučení z aktivovaných endotelových buněk a destiček interaguje se svými ligandy, které jsou exprimovány nejen na bílých krvinkách, ale také na nádorových buňkách (62). Tato interakce umožňuje obalení nádorových buněk krevními destičkami, což usnadňuje jednak metastazování a také iniciuje koagulaci (63).

KREVNÍ DESTIČKY V NÁDOROVÉM MIKROPROSTŘEDÍ: ZÁNĚT, AKTIVACE ENDOTELU, NÁDOROVÁ ANGIOGENEZE

Agregace a aktivace trombocytů je navozena nejen nádorovými buňkami, ale i dalšími komponentami mikroprostředí nádoru. Do nádoru jsou atrahovány leukocyty s prozánětlivým efektem, které paradoxně některými svými vlastnostmi podporují růst nádoru. Z toho pohledu jsou významné především TAM (tumor-associated macrophages M2), které mohou tvořit podstatnou část nádorové masy a jejichž přítomnost v nádoru je spojena s progresí onemocnění (64, 65). Ve vztahu ke krevním destičkám a jejich aktivaci je podstatné značné množství tkáňového faktoru obsaženého v makrofázích. Dalším významným stimulátorem destiček v nádorovém mikroprostředí je povrch endotelových buněk nedokonalé nezralé nádorové vaskulatury, kde dochází k expozici makromolekul subendotelové extracelulární matrix, jako je kolagen a von Willebrandův faktor (vWF), jež jsou významným aktivátorem krevních destiček (66). Popsaná aktivace destiček v nádorovém mikroprostředí je autokrinně potencována působením trombocytárních proaktivačních a proagregačních faktorů.

Během růstu primárního nádoru a metastáz dochází ke vzniku hypoxie v jeho vnitřních částech, kam se nedostává kyslík difuzí. Tato hypoxie stimuluje vznik vaskulatury v nádorové lézi. Zásadní úlohu v neovaskularizaci nádoru hraje VEGF, který je ve vysokých koncentracích obsažen v krevních destičkách, a jeho uvolnění z trombocytů po aktivaci podporuje angiogenezi (67, 68). Krevní destičky obsahují ale také další faktory ovlivňující fyziologickou a nádorovou angiogenezi (tab. 1). Obecně lze říci, že při hojení rány jsou v první fázi z trombocytů uvolněny pro-angiogenní faktory a ve druhé fázi je proces neovaskularizace potlačen anti-angiogenními působky krevních destiček a stromálních buněk. S tímto jevem souvisí kupříkladu různá odpověď na selektivní stimulaci trombinových receptorů. Po stimulaci PAR-1 dochází k uvolnění VEGF za současné inhibice sekrece endostatinu. Aktivací PAR-4 dochází k sekreci endostatinu s potlačením sekrece VEGF, a tím k inhibici nádorové angiogeneze (9, 66). Z trombocytů aktivovaných trombinem byl dále izolován destičkový faktor-4 (PF-4) neboli CXCL4, chemokin inhibující angiogenezi. Angiostatický účinek je zprostředkován například vazbou PF-4 na VEGF a bFGF a kompeticí s těmito růstovými faktory o vazbu na heparan sulfát, čímž inhibuje jejich vazbu na receptory, a brání tak angiogenezi (69–71). Odlišný efekt trombinu na uvolnění destičkových faktorů a fakt, že angiogenní a angiostatické proteiny jsou umístěny odděleně v různých subpopulacích α-granulí, poukazuje na selektivní regulaci angiogeneze prostřednictvím krevních destiček. V souvislosti s vysokým obsahem regulátorů angiogeneze v trombocytech a jejich v řadě případů anti-angiogenní úlohou se uvažuje také o potenciálu destiček zadržovat tyto látky a blokovat tak jejich dostupnost v místě procesu neovaskularizace. Trombocyty pacientů s kolorektálním karcinomem obsahují vyšší hladiny pro-angiogenního VEGF i anti-angiogenního endostatinu a trombospondinu-1 (72) a bylo pozorováno, že trombocyty preferenčně vychytávají faktory (GM-CSF, TPO, TNF-α, TGF-β1 a MCP-1) produkované nádorem oproti faktorům produkovaným zdravou tkání (73).

KREVNÍ DESTIČKY A METASTAZOVÁNÍ

Vznik trombocytárních agregátů a uvolňování destičkových faktorů – např. matrixových metaloproteináz v místě primárního nádoru přispívá k porušení vrstvy endotelových buněk nebo degradaci subendoteliální matrix. To podporuje extravazaci nádorových buněk, a tím jejich šíření do sekundárních míst a vznik metastáz (120).

TCIPA vede nejen k tvorbě trombocytárních agregátů, ale také ke vzniku agregátů trombocytů a nádorových buněk. Destičky tak přispívají k metastazování nádorových buněk jejich ochranou před fyzikálními stresory v krevním řečišti (121). Agregáty mají také vyšší přilnavost k endotelovým buňkám a aktivované destičky uvolňují mediátory, které způsobují rozrušení extracelulární matrix a vazokonstrikci (serotonin) v místě vzniku nové metastázy. Nádorové buňky obalené trombocyty jsou také do určité míry chráněny před buňkami imunitního systému. Byl popsán protektivní účinek destiček před cytotoxickým působením TNF-α (122). Zásadní význam má ale pravděpodobně ochrana nádorových buněk krevními destičkami před cytolýzou navozenouNK-buňkami (123–125).

TROMBOCYTÁRNÍ MIKROPARTIKULE V PROGRESI SOLIDNÍCH NÁDORŮ

Z aktivovaných destiček se uvolňují destičkové mikropartikule (PMP), malé vezikuly, obsahující různé cytokiny a růstové faktory, např. VEGF a bFGF (126). Destičkové mikropartikule tvoří největší podíl cirkulujících mikropartikulí v krvi, přestavují 70–90 % (127, 128). Zvýšené hladiny destičkových mikropartikulí doprovází řadu onemocnění včetně karcinomu, aterosklerózy, sepse a diabetu (129). Role PMP ve vývoji nádoru není zcela známá, nicméně vysoké hladiny PMP korelují s agresivními nádory a špatným klinickým stavem (127). PMP mohou exprimovat a nést funkční receptory destičkových membrán, stimulovat expresi adhezních molekul na buňkách a uvolňování cytokinů, aktivovat nitrobuněčné signální dráhy, podporovat angiogenezi in vitro a podílet se na regeneraci tkáně a metastazovaní nádorů. PMP stimulují proliferaci a adhezi nádorových buněk (129). U karcinomu žaludku bylo prokázáno, že hladina PMP je lepším ukazatelem metastazování než VEGF, IL-6 nebo RANTES (130). U buněk nádorů prostaty indukují PMP sekreci MMP-2 usnadňující průchod kolagenem, který je hlavní složkou extracelulární matrix (131). PMP slouží jako chemoatraktans pro některé buněčné linie nádoru plic, aktivují fosforylaci signálních molekul a expresi membránové matrix metaloproteinázy typu 1 (127, 132). PMP regulují proliferaci a adhezi nádorových buněk k fibrinogenu a endoteliálním buňkám (132). Na buněčných liniích nádorů prsu bylo prokázáno, že PMP ovlivňují chemoinvazi bazální membránou (133).

ANTIKOAGULAČNÍ LÉČBA A TERAPEUTICKÁ INHIBICE AGREGACE KREVNÍCH DESTIČEK VE VZTAHU K PREVENCI A LÉČBĚ NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ

Je otázkou, zda má antikoagulační léčba heparinem a nízkomolekulárními hepariny LMWH léčebný účinek u nádorů. Předpokládá se inhibiční efekt nízkomolekulárních heparinů na proces angiogeneze, zánětu a vliv na regulaci buněčné adheze, proliferace, mobility, růstových a koagulačních faktorů (134). Byl popsán pozitivní efekt heparinu na diferenciaci a apoptózu (135). LMWH může prodloužit přežívání pacientů s pokročilým maligním onemocněním (136). Využití protinádorového potenciálu heparinu/LMWH v praxi bude možné až po ověření v klinických studiích. Profylaktické nebo léčebné podání při venózní trombembolii u pacientů s nádorem vyžaduje pečlivou monitoraci nežádoucích účinků, vzniku heparinem indukované trombocytopenie (HIT), krvácivých komplikací nebo lékových interakcí.

Antitrombotická léčba ve smyslu antitrombocytárních přípravků zahrnuje inhibici cyklooxygenázy-2 (kyselina acetylsalicylová/aspirin), inhibici fosfodiesteráz (dipyridamol; mopidamol/RA-233), protilátky proti glykoproteinu IIb–IIIa (intravenózní Abciximab, perorální XV459), inhibici PAR-1 (vorapaxar, atopaxar), inhibici P2Y12 receptoru (klopidogrel, prasugrel, tiklopidin, elinogrel a další).

Nejběžnějším inhibitorem agregace krevních destiček je kyselina acetylsalicylová (aspirin). Metaanalýza čtyř randomizovaných studií zhodnotila efekt aspirinu versus placeba v primární a sekundární prevenci cévních příhod a rizika kolorektálního karcinomu v průběhu 20letého sledování 14 033 subjektů. Pětiletá léčba aspirinem snižuje riziko karcinomu proximální části tlustého střeva o 70 % a také snižuje riziko rektálního karcinomu. Vyšší dávky než 75 mg nepřináší větší benefit a velmi nízké dávky aspirinu (30 mg denně) neměly význam v prevenci kolorektálního karcinomu. Při pravidelném užívání 75 mg aspirinu/den došlo k téměř 20% snížení mortality na kolorektální karcinom, tento přínos se začal projevovat již po 5. roce užívání aspirinu (137). Snížení incidence i šíření adenokarcinomů v gastrointestinální oblasti je třeba ozřejmit v prospektivních studiích u onkologických onemocnění, také s ohledem na rizika dlouhodobého užívání aspirinu, zejména krvácení.

Výsledky klinických hodnocení vztahu anti-trombocytárních přípravků ve vztahu k prognóze onkologických onemocnění jsou shrnuty v tabulce 2.

Experiment na myším modelu ukázal, že inhibice agregace krevních destiček aspirinem a/nebo klopidogrelem potlačuje hepatokarcinogenezi po chronické infekci virem hepatitidy B (138). Abciximab inhibuje agregaci destiček a je indikován k prevenci kardiálních ischemických komplikací zejména po perkutánních intervencích (angioplastikách), u akutních koronárních syndromů. Předpokládá se anti-angiogenní a také protinádorový účinek abciximabu. Blokáda GPIIb/IIIa vede k ovlivnění adheze nádorových buněk, jejich metastatazování a invazi (51, 139).

ANTI-ANGIOGENNÍ LÉČBA A TROMBOTICKÉ KOMPLIKACE

Zajímavá je otázka vlivu monoklonální protilátky bevacizumabu na funkci krevních destiček. Systémová léčba bevacizumabem je spojena s vyšším výskytem arteriální a venózní trombembolie a hemoragií (152). Přesná příčina vzniku cévních příhod při léčbě bevacizumabem není známá. Teoreticky lze předpokládat změny endoteliálních buněk, jejich nefyziologickou apoptózu jako důsledek inhibice VEGF. Tato hypotéza je založena na vlivu VEGF v udržování fyziologických funkcí endotelií (153). Abnormální apoptóza endoteliálních buněk umožní expozici vysoce protrombotických fosfolipidů bazální membrány a současně vede ke ztrátě integrity endoteliální výstelky s následným krvácením (154). Protrombotický efekt anti-VEGF agens může souviset také s potlačením destičkových inhibitorů prostaglandinu I-2 a NO, jejichž nižší hladiny působí zvýšenou aktivaci destiček a zvýšenou incidenci trombembolie (155). U myšího modelu byl prokázán vznik imunokomplexů s bevacizumabem, jež aktivovaly krevní destičky a vedly k trombóze (156).

Analýza dat 1745 pacientů z pěti randomizovaných studií léčených bevacizumabem v kombinaci s chemoterapií prokázala zvýšené riziko vzniku arteriální, ale nikoliv venózní trombembolie u 3,8 % pacientů oproti 1,7 % v kontrolní skupině. Nejčastěji popsanou událostí byl infarkt myokardu a cerebrovaskulární příhody. Vznik arteriální trombembolie (ATE) souvisel s již předcházejícím výskytem ATE nebo s věkem nad 65 let včetně (157).

Metaanalýza 7956 pacientů z 15 klinických studií (léčených standardní chemoterapií s nebo bez bevacizumabu) prokázala výskyt všech stupňů závažnosti venózní trombembolie u 11,9 % a vysokého stupně závažnosti u 6,3 % případů (158).

Další metaanalýza 7441 pacientů ze 17 klinických studií byla provedena s cílem stanovení relativního rizika venózní trombembolické příhody u pacientů léčených VEGFR tyrozinkinázovými inhibitory (TKIs): sunitinib, sorafenib, pazopanib, vandetanib a axitinib. Relativní riziko všech stupňů a vysokého stupně venózní trombembolie v ramenech s TKI a bez TKI bylo 1,10 a 0,85 bez prokázané statistické významnosti. Metaanalýza nepotvrdila souvislost mezi léčbou VEGFR TKIs a rizikem vzniku venózní trombembolie (159).

ZÁVĚR

Krevní destičky přispívají k růstu nádoru a k jeho šíření na několika úrovních, jak je schematicky uvedeno na obrázku 2. Z pohledu neovaskularizace/angiogeneze i úlohy imunitního systému je možné progredující nádor považovat za nehojící se ránu (160). V prvních fázích hojení rány, podobně jako při progresi tumoru, dochází k aktivaci koagulace; trombocyty a leukocyty uvolňují cytokiny podporující prokrvení a začínají se tvořit nové cévy. Ve finální fázi hojení krevní destičky zajišťují potlačení angiogeneze, k čemuž při progresi nádoru zpravidla nedochází. Nádor se naopak chová spíše jako zanícená rána, ve které jsou cévní stěny propustné a leukocyty (neutrofily a monocyty) přispívají k angiogenezi a růstu nádorových buněk. Krevní destičky a destičkové mikropartukule přispívají ke vzniku hematogenních metastáz a konzistentně s tímto faktem vede protidestičková léčba v řadě případů k lepšímu průběhu či prevenci onkologických onemocnění.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky projektem OPVaVpI (reg. č. CZ.1.05/2.1.00/03.0101) pro Regionální centrum aplikované molekulární onkologie RECAMO.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

RNDr. Lenka Zdražilová-Dubská, Ph.D.

Oddělení laboratorní medicíny

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7, 656 53 Brno

e-mail: dubska@mou.cz