Vliv délky kultivace embryí s pomalým nástupem dělení na úspěšnost IVF

Influence of the length of cultivation of no early cleavage embryos on the IVF success rate

Objective of the study:
To evaluate the success of treatment cycle after transfer of no early cleavage embryos in relation to the length of in vitro cultivation.

Type of the study:
Retrospective study.

Setting:
Dept. of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacky University and University Hospital Olomouc.

Methods:
The IVF cycles with transfer of no early cleavage (NEC) embryos, ie. embryos with a delayed cleavage were evaluated in relation to the length of in vitro cultivation. The total of 338 embryos were cultured for three days (group 3D) and 204 embryos were cultured for 5 days (group 5D). The input parameters of the patients in these two groups were: their age, the percentage of fertilized oocytes and the number of transferred embryos. As the output parameters the number of cancelled cycles, clinical pregnancy rate (PR/ET), implantation rate (IR), and the number of pregnancy losses (AB) were evaluated. Finally, the results of these pregnancies were also evaluated.

Results:
Both study groups had the same input parameters, except that fewer embryos were transferred in the group 5D than in 3D (1.8 ± 0.5 vs. 2.0 ± 0.5,p = 0.000).

No cycles were cancelled in the group 3D while 33 cycles were cancelled in 5D (p = 0.000). The number of clinical pregnancies and implantation rate in the group 5D was significantly higher than in 3D (PR/ET 50% vs. 37%, IR 36% vs. 25%, p = 0.001). The groups did not statistically significantly differ in the number of pregnancy losses, or in the number of pregnancies that resulted in childbirth.

Conclusion:
In the 5D group with the longer in vitro cultivation statistically more pregnancies and implanted embryos were achieved, although the number of pregnancies that resulted in childbirth did not differ between groups.

Keywords:
embryo development – pregnancy – IVF – pregnancy outcomes

Autori: M. Řeřuchová ¹; J. Březinová ^2,3; R. Filipčíková ³; I. Oborná ⁴
Pôsobisko autorov: Ústav biologie LF UP, Olomouc, přednosta doc. RNDr. V. Divoký, Ph. D. ¹; Arleta – Centrum reprodukčního zdraví, s. r. o., vedoucí MUDr. J. Doležal ²; Ústav normální anatomie LF UP, Olomouc, přednosta doc. MUDr. S. Laichman, CSc. ³; Porodnicko-gynekologická klinika FN a LF UP, Olomouc, přednosta prof. MUDr. R. Pilka, Ph. D. ⁴
Vyšlo v časopise: Ceska Gynekol 2013; 78(1): 68-72

Súhrn

Cíl studie:
Zhodnotit úspěšnost léčebného cyklu po transferu embryí s pomalým nástupem dělení v závislosti na délce kultivace in vitro.

Typ studie:
Retrospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Porodnicko-gynekologická klinika LF UP a FN Olomouc.

Metodika:
V závislosti na délce kultivace in vitro byly hodnoceny cykly s transferem no early cleavage (NEC), tj. embryí s pomalým nástupem dělení. V souboru 3D (n = 338) byla embrya kultivována tři dny, v souboru 5D (n = 204) pět dní. U pacientek zařazených do jednotlivých souborů byly hodnoceny jako vstupní parametry věk pacientky, procento oplozených oocytů a počet transferovaných embryí. Jako výstupní parametry jsme hodnotili počet zrušených cyklů, počet získaných klinických těhotenství(PR/ET), implantační poměr (IR), počet těhotenských ztrát (AB). Dále byly hodnoceny výsledky těchto těhotenství.

Výsledky:
Oba hodnocené soubory měly stejné vstupní parametry, kromě toho, že v souboru 5D bylo transferováno méně embryí než v 3D (1,8 ± 0,5 vs. 2,0 ± 0,5, p = 0,000).

V souboru 5D bylo zrušeno 33 cyklů, zatím co v 3D žádný (p = 0,000). Počet klinických těhotenství a implantační poměr ve skupině 5D byl vyšší než v 3D na hladině významnosti p = 0,001 (PR/ET 50 % vs. 37 %, IR 36 % vs. 25 %). Soubory se statisticky významně nelišily v počtu těhotenských ztrát, ani v počtu těhotenství ukončených porodem.

Závěr:
V souboru 5D s prodlouženou kultivací in vitro bylo dosaženo signifikantně více těhotenství i implantovaných embryí, při přenosu nižšího počtu embryí, přestože se oba soubory se nelišily v počtu těhotenství ukončených porodem.

Klíčová slova:
vývoj embrya – těhotenství – IVF – těhotenské výsledky

ÚVOD

Centra asistované reprodukce se v současné době snaží snížit počet vícečetných těhotenství po metodách asistované reprodukce transferem jednoho, maximálně dvou nejkvalitnějších embryí. Úkolem embryologa je tedy vybrat k přenosu na základě řady hodnotících parametrů embryo nebo embrya s nejlepší prognózou implantace. Tato tzv. top embrya mohou být vybírána např. podle morfologie (počet a velikost blastomer, stupeň fragmentace), rychlosti nástupu prvního buněčného dělení, nebo na základě kontinuálního sledování vývoje pomocí kamer (Primo Vision, Embryoscope). U indikované skupiny pacientek mohou být aneuploidní embrya eliminována pomocí preimplantační genetické diagnostiky.

Úspěšnost cyklů s přenosem tzv. early cleavage (EC) embryí byla doložena v řadě zahraničních publikací [např. 8, 13, 17, 18, 19], výsledky z pracoviště LF UP a FN Olomouc byly publikovány spoluautory tohoto článku [3–7]. Cílem této práce bylo vyhodnocení úspěšnosti cyklů v závislosti na délce kultivace embryí, ve kterých byla všechna embrya klasifikována jako tzv. no early cleavage (NEC).

SOUBOR A METODIKA

Do retrospektivní studie byly zařazeny cykly IVF/ICSI s přenosem nebo bez přenosu embryí, které proběhly v Centru asistované reprodukce Porodnicko-gynekologické kliniky LF UP a FN Olomouc od ledna 2006 do prosince 2009. Bylo hodnoceno celkem 542 cyklů, u kterých byla všechna embrya klasifikována jako NEC, buď pouze s rozpuštěnou karyolemou prvojader, nebo se zachovanými prvojádry. Přenosem embryí po třídenní kultivaci bylo ukončeno všech 338 cyklů (soubor 3D). U zbývajících 204 cyklů byla kultivace prodloužena na pět dnů (soubor 5D), ale jen u 171 cyklu bylo podle vývoje embryí rozhodnuto o transferu a 33 cykly byly ukončeny bez transferu.

Stimulace ovarií probíhala podle tří protokolů užívaných na pracovišti CAR FNOL [5] – (1) dlouhý folikulární (depotní) protokol s GnRH-agonisty a s rekombinantním FSH, (2) protokol s GnRH antagonisty a rekombinantním FSH, (3) protokol s antiestrogeny, močovým hMG nebo FSH. Cyklus byl monitorován od 8. dne stimulace transvaginální ultrasonografií. Jestliže dva nebo více folikulů dosáhlo velikosti ≥ 20 mm, byl k indukci ovulace aplikován lidský choriogonadotropní hormon (hCG) v dávce 5000 nebo 10 000 IU do svalu. Transvaginální punkce folikulů pod sonografickou kontrolou v celkové anestezii byla provedenaza 34–36 hodin po aplikaci hCG. Za 3–6 hodin po nalezení oocytů bylo oplozování provedeno metodou klasického IVF, ICSI nebo kombinací obou metod.

K oplození metodou ICSI byly použity pouze oocyty v metafázi II. zracího dělení (MII), zatímco při klasickém IVF byly oplozovány všechny nalezené oocyty. Oocyty a embrya byly kultivovány v kultivačních médiích (Vitrolife, Sweden) ve čtyřjamkových miskách nebo v kapkách vždy pod olejem (Liquid Parafine, Origio – Medicult, Denmark). Přítomnost dvou prvojader (2PN), tedy jasná známka oplození, byla hodnocena za 16–20 hodin po inseminaci/ICSI. Abnormálně oplozené oocyty (1PN, 3PN) nebyly do dalšího hodnocení zahrnuty. Kontrola nástupu prvního buněčného dělení probíhala za 22–25 hodin od inseminace nebo ICSI. Do hodnocených souborů byly zařazeny pouze cykly s NEC embryi.

Vstupními parametry byl věk pacientek, procento oplozených oocytů (FR – fertility rate), počet hodnocených embryí a průměrný počet transferovaných embryí.

Výstupní parametry zahrnovaly počet cyklů s transferem nebo bez transferu, klinické těhotenství diagnostikované na základě ultrazvukového určení počtu gestačních váčků s nebo bez přítomné srdeční akce (pregnancy rate, PR), implantační poměr (IR) definovaný jako počet gestačních váčků s akcí srdeční na počet transferovaných embryí a těhotenské ztráty (AB). Výsledky těhotenství (porod, těhotenské ztráty) byly získány ze zpráv o porodu.

Statistické zpracování bylo provedeno pomocí softwarových systémů pro analýzu dat STATISTICA (StatSoft ČR s.r.o. (2007) verze 8.0. www.statsoft.cz) a SPSS v. 12.0. S ohledem na typ dat byl použit dvouvýběrový t-test, test pro porovnání dvou poměrů a χ² test. Při všech výpočtech byla uvažována 5% hladina významnosti.

VÝSLEDKY

Za sledované období proběhlo celkem 542 cyklů, ve kterých byla všechna získaná embrya hodnocena jako NEC. Ve 338 z nich (62,4 %) proběhla třídenní kultivace (soubor 3D), u 204 (37,6 %) pětidenní kultivace (soubor 5D).

Vstupní parametry obou souborů se statisticky významně lišily pouze v počtu přenášených embryí (tab. 1). V souboru 5D bylo přenášeno méně embryí než v souboru 3D (1,8 ± 0,5 vs. 2,0 ± 0,5,p = 0,000). V souboru 3D byla přenášena embrya ve stadiu 2–10 buněk, průměrný počet blastomer byl 7,5 ± 1,3. V souboru 5D byla nejčastěji přenášena embrya ve stadiu časné blastocysty (50 %), moruly (33 %) nebo expandované blastocysty (17 %). Ostatní sledované vstupní parametry byly bez statisticky významného rozdílu.

Porovnání výstupních parametrů shrnuje tabulka 2. V souboru s třídenní kultivací skončily všechny cykly přenosem embryí, zatím co při pětidenní kultivaci bylo zrušeno 16,2 % cyklů, protože embrya nebyla vhodná k transferu (p = 0,000). Další statisticky průkazné rozdíly byly zjištěny v PR/ET(p = 0,001) a IR (p = 0,001), úspěšnější byly cykly s pětidenní kultivací. Počet těhotenství ukončených porodem se statisticky významně nelišil, stejně jako počet těhotenských ztrát (tab. 2).

**Tab. 2. Hodnocené výstupní parametry**

DISKUSE

Stále více studií se zabývá hledáním neinvazivních hodnotících kritérií, která by umožňovala vybrat nejkvalitnější a nejživotaschopnější embryo pro transfer. Jednou z možností je výběr embrya na základě hodnocení doby nástupu prvního buněčného dělení, kterou poprvé publikovali Shoukiret al. [19] a Sakkas et al. [17]. Později bylo v souborech s transferem jediného embrya Salumets et al. [18] prokázáno, že rychlost nástupu prvního mitotického dělení je významným ukazatelem kvality a vitality embryí, projevující se jejich vyšší implantační schopností (PR 50 % EC vs. 27 % NEC embrya).

Bohužel v praxi se setkáváme i s cykly, ve kterých nejsou žádná EC embrya a všechna embrya jsou klasifikována jako NEC. Některé literární zdroje uvádějí, že IR je vyšší u embryí s prodlouženou dobou kultivace do 5. dne vývoje [1, 9, 12]. Je také známo, že in vivo vstupuje embryo do dělohy během 4. dne svého vývoje, kdy dochází k aktivaci genomu a jeho vyšší aktivita se může projevit i vyšší schopností implantace [7].

Na druhé straně při prodloužené kultivaci při suboptimálních in vitro podmínkách může dojít u embrya k zástavě dělení a léčebný cyklus musí být ukončen bez transferu. Potvrzují to i naše výsledky, kdy v souboru 5D došlo k ukončení 16,4 % cyklů, zatímco v souboru 3D nebyl zrušen ani jeden cyklus. Podobné závěry uvedli Kolibianakis et al. [12],kteří po pětidenní kultivaci ukončili 9,1 %, cyklů vs. 1,8 % po třídenní kultivaci. I Coskun et al. [9] prokázali, že při prodloužené kultivaci se zvyšuje počet cyklů, které jsou ukončeny bez ET a navíc se snižuje možnost zamražení nadpočetných embryí.

Při porovnávání počtu dosažených klinických těhotenství vztažených na ET jsme nalezli statisticky průkazný rozdíl v PR i IR ve prospěch prodloužené kultivace, přestože se v souboru 5D přenášel signifikantně nižší počet embryí. Coskun et al. [9] uvádí vyšší počet těhotenských ztrát v souboru po třídenní kultivaci, 12 % vs. 8 % při pětidenní kultivaci. V našem souboru s přenosem třídenních NEC embryí jsme zaznamenali nesignifikantně méně těhotenských ztrát.

Přestože v souboru s prodlouženou kultivací bylo dosaženo více klinických těhotenství, při porovnávání výsledků těhotenství nebyl mezi sledovanými soubory statisticky významný rozdíl. K zamyšlení je skutečnost, že v souboru s prodlouženou kultivací NEC embryí bylo třikrát (3,5 %) ukončeno těhotenství z genetické indikace. V běžné populaci se vrozené vývojové vady (VVV) vyskytují v různém rozsahu postižení asi u 3 % případů. Vzhledem k věku pacientek (38, 38 a 39 let) však nemusí být výskyt VVV ovlivněn procesy asistované reprodukce.

Porovnávání dosažených výsledků těhotenství ve smyslu porodu zdravého dítěte v závislosti na délce kultivace in vitro s literárními údaji je velmi obtížné, protože publikované studie vyhodnocují různé vstupní i výstupní parametry. Např. v rozsáhlé švédské studii Källén et al. [11] porovnávali neonatologické výsledky cyklů s přenosy nižších stadií embryí, blastocyst a obecnou populací. U novorozenců po přenosu blastocyst zjistili vyšší výskyt předčasných porodů, nízkou porodní hmotnost i snížené Apgar skóre. Naopak Wang et al. [20] prokázali celkově lepší výsledky těhotenství po přenosu blastocyst. S tendencí snižovat počet přenášených embryí ve světě stoupá počet cyklů s přenosem blastocyst, protože tzv. top embryu prodloužená kultivace in vitro neškodí [2, 15, 16]. Časosběrné kamery systémů PrimoVision nebo Embryoscop umožňují sledovat rychlost nástupu prvního buněčného dělení bez nutnosti manipulace s embryi mimo inkubátor. To může přispět k širšímu použití tohoto kritéria k výběru nejvhodnějších embryí k přenosu [10, 14].

ZÁVĚR

V naší studii jsme nalezli statisticky významně vyšší PR a IR po přenosu blastocyst v porovnání se souborem, ve kterém se přenášela nižší vývojová stadia embryí. Přesto procento těhotenství ukončených porodem bylo v obou souborech srovnatelné.

Průběh léčebného cyklu a délka kultivace by měly být vždy individuálně posouzeny lékařem a embryologem se zřetelem na anamnézu páru, počet a průběh prodělaných cyklů IVF, počet odebraných a úspěšně oplodněných oocytů a kvalitu embryí v právě probíhajícím cyklu. Stejně tak je nutno brát ohled i na přání léčeného páru a uvážit i psychickou zátěž v případě zrušení transferu.

Poděkování

Autoři článku děkují RNDr. Mileně Krškové a Mgr. Lence Radové, Ph.D., za statistické zpracování použitých dat,doc. ing. Heleně Fingerové, CSc., za korekci textu.

Mgr. Marie Řeřuchová

Ústav biologie LF UP a FN

Hněvotínská 3

775 15 Olomouc

e-mail: M.Reruchova@seznam.cz

Zdroje

1. Beesley, R., Robinson, R., Propst, A., et al. Impact of day 3 or day 5 embryo transfer on pregnancy rates and multiple gestations. Fertil Steril, 2009, 91, 5, p. 1717–1720.

2. Butterworth, S. Blastocyst culture: myth or magic? Hum Fertil (Camb)., 2001, 4, 2, p. 109–116.

3. Březinová, J., Oborná, I., Svobodová, M., et al. Embrya s časným dělením (early cleavage) a jejich vliv na výsledky klasického IVF. Čes Gynek, 2003, 68, 6, s. 449–453.

4. Březinová, J., Svobodová, M., Kršková, M., et al. Vliv časného nástupu prvního buněčného dělení po vpichu spermie do cytoplasmy oocytu (ICSI) na výsledky IVF + ET. Čes Gynek, 2004, 69, 1, s. 37–42.

5. Březinová, J., Svobodová, M., Oborná, I., et al. Kvalita embryí po klasickém IVF v závislosti na rychlosti nástupu prvního buněčného dělení. Čes Gynek, 2006, 71, 2, s. 105–110.

6. Březinová, J., Svobodová, M., Oborná, I., et al. Kvalita embryí po ICSI v závislosti na rychlosti nástupu prvního buněčného dělení. Čes Gynek, 2006, 71, 3, s. 204–208.

7. Březinová, J., Oborná, I., Svobodová, M., Fingerová, H. Evaluation of day one embryo quality and IVF outcome – a comparison of two scoring systems. Reprod Biol Endocrinol., 2009, doi: 10.1186/1477-7827-7-9.

8. Conaghan, J., Hardy, K., Leese, H., et al. Culture of human preimplantation embryos to the blastocyste stage: a comparison of 3 media. Int J Dev Biol, 1998, 42, 7, p. 885–893.

9. Coskun, S., Hollanders, J., Al-Hassan, S., et al. Day 5 versus day 3 embryo transfer: a controlled randomized trial. Hum Reprod, 2000, 15, 9, p. 1947–1952.

10. Hlinka, D., Lazarovská, S., Rutarová, J., et al. Non-invasive monitoring of the timing of early embryo cleavages-objectively measurable predictor of human embryo viability. Čes Gynek, 2012, 77, 1, s. 52–57.

11. Källén, B., Finnström, O., Lindam, A., et al. Blastocyst versus cleavage stage transfer in in vitro fertilization: differences in neonatal outcome? Fertil Steril, 2010, 94, 5, p. 1680–1683.

12. Kolibianakis, EM., Zikopoulos, K., Verpoest, W., et al. Should we advise patients undergoing IVF to start a cycle leading to a day 3 or a day 5 transfer? Hum Reprod, 2004, 19, 11, p. 2550–2554.

13. Lundin, K., Bergh, C., Hardarson, T. Early embryo cleavage is a strong indicator of embryo quality in human IVF. Hum Reprod, 2001, 16, 12, p. 2652–2657.

14. Montag, M., Liebenthorn, J., Kőster M. Which morphological scoring system is relevant in human embryo development? Placenta, 2011, 32, p. 252–256.

15. Papanikolaou, SG., Camus, M., Kolibianakis, EM., Van Landuyt, L. In vitro fertilization with single blastocyst-stage versus single cleavage-stage embryos. N Engl J Med, 2006, 354, 11, p. 1139–1146.

16. Papanikolaou, SG., Kolibianakis, EM., Tournaye, H., et al. Live birth rates after transfer of equal number of blastocysts or cleavage-stage embryos in IVF. A systematic review and meta-analysis. Hum Reprod, 2008, 23, 1, p. 91–99.

17. Sakkas, D., Shoukir, Y., Chardonnes, D., et al. Early cleavage of human embryos to the two-cell stage after intracytoplasmic sperm injection as an indicator of embryo viability. Hum Reprod, 1998, 13, 1, p. 182–187.

18. Salumets, A., Hydén-Granskog, C., Mäkinen, S., et al. Early cleavage predicts the viability of human embryos in elective single embryo transfer procedures. Hum Reprod, 2003, 18, 4, p. 821–825.

19. Shoukir, Y., Campana, A., Farley, T., Sakkas, D. Early cleavage of in-vitro fertilized human embryos to the 2-cell stage: a novel indicator of embryo quality and viability. Hum Reprod, 1997, 12, 7, p. 1531–1536.

20. Wang, YA., Chapman, M., Costello, M., Sullivan, EA. Better perinatal outcomes following transfer of fresh blastocysts and blastocysts cultured from thawed cleavage embryos: a population-based study. Hum Reprod, 2010, 25, 6, p. 1536–1542.