Opakované selhání implantace embrya a trombofilie

Souhrn

Cíl práce:
Přinést ucelený přehled dostupných poznatků o významu trombofilních mutací u pacientek s opakovaným selháním implantace a shrnout možnosti terapie.

Typ studie:
Přehledová studie.

Název a sídlo pracoviště:
Porodnicko-gynekologická klinika FN, Olomouc.

Metodika:
Analýza literárních zdrojů a databází Ovid, Medline.

Závěr:
Selhání implantace v rámci asistované reprodukce je dáváno do souvislosti se zhoršenou receptivitou endometria. U žen s normální anatomií mohou mít vliv na uhnízdění embryí hormonální změny jako následek stimulace, imunologické vlivy nebo trombofilní mutace. Pacientky s opakovaným selháním implantace embrya by měly být testovány na přítomnost trombofilních mutací. Individuálně by následně měla být pečlivě zvážena aplikace nízkomolekulárního heparinu. Podle dostupných dat má význam nasazení léčby jen u pacientek s prokázanou získanou nebo vrozenou trombofilní poruchou.

Klíčová slova:
IVF, trombofilie, opakované selhání implantace

ÚVOD

Implantace embrya je jedním z nejkritičtějších momentů určujících úspěch umělého oplodnění. Jedná se o komplexní proces, který závisí na mnoha faktorech. Proces implantace může být rozčleněn do tří fází: apozice, adheze a invaze. Během apozice blastocysty buňky trofoblastu adherují k endometriu. Blastocysta následně proniká k bazální membráně endometria a ke stromální extracelulární matrix. Následně dochází k penetraci blastocysty. I přesto, že blastocysta je schopna implantovat v různých druzích tkáně v lidském těle, překvapivě v endometriu je možná implantace blastocysty jen v časově omezenémobdobí. Jedná se o 20.–24. den menstruačního cyklu. Během tohoto krátkého období, které je nazýváno window of implantation, je lidské endometrium připraveno k implantaci blastocysty [25]. Jedna třetina neúspěchu IVF je připisována na vrub kvality embrya, zbylé dvě třetiny jsou připisovány nedostatečné receptivitě endometria [7, 16, 29]. Jedná se o ženy, u kterých i přes kvalitní embrya, dobrou hormonální odpověď a dostatečnou výšku endometria nedochází k implantaci. K selhání implantace dochází až u 50 % transferovaných blastocyst u žen mladších než 35 let [14]. Rekurentní selhání implantace, recurrent implantation failure (RIF), je iatrogenní komplikací, která je definována v dostupné literatuře ne zcela jednoznačně. Liší se podle autorů a je definována na základě počtu konsekutivních cyklů IVF, počtu transferovaných embryí či kombinací obojího. Jako jakýsi konsenzus se používá ne zcela přesná definice. O RIF se hovoří, pokud nedojde ke vzniku gravidity po třech po sobě následujících transferech jednoho nebo více kvalitních embryí [9].

IMPLANTACE

Implantace může být úspěšná, jenom pokud dojde k synchronizaci preembryonálního vývoje a endometria. Příprava endometria není závislá jen na hormonální stimulaci, ale i na recipročním dialogu mezi blastocystou a endometriem. Tento dialog je zprostředkován cytokiny, růstovými faktory a adhezivními molekulami, které produkuje endometrium i blastocysta.

K fertilizaci zralého oocytu v metafázi II dochází v ampulární části vejcovodu. Vzniklé preembryo je transportováno tubárními kontrakcemi a ciliární aktivitou. Do dělohy doputuje embryo ve stadiu moruly 72 hodin po ovulaci. Během několika hodin dochází k dalšímu mitotickému dělení a v této chvíli je embryo volně v děložní dutině. Podmínkou implantace je vývoj embrya do stadia blastocysty s trofektodermem a embryoblastem. Během svého vývoje se embryo musí uvolnit ze své zóny pellucidy, aby mohlo volně přilnout k povrchu endometria, čemuž říkáme apozice. Zdá se, že proces uvolňování embrya ze zóny pellucidy řídí samo embryo. Dochází ke ztenčování a degradaci zóny pellucidy, což umožní kontakt mezi trofektodermem a luminálními epiteliemi endometria [8]. Při pozorování morfologie endometria elektronovým mikroskopem byly v období implantačního okna zjištěny na endometriu významné změny. Zřejmě vlivem progesteronu dochází k regresi mikrovilů a cilií a dochází k protruzi pinopodií [22]. Pinopodie byly nalezeny v 78 % endometriálních biopsií 6. den po ovulaci, méně často pak i 2. a 9. den. Dočasná exprese pinopodií zřejmě bude hrát významnou, ale zatím nejasnou roli v implantaci. Zda se jedná o pinocytózu/endocytózu tekutiny z děložní dutiny, nebo zda pinopodie přispívají ke zvětšení povrchu, a tak zlepšení kontaktu blastocysta – epitelie, není dosud vyjasněno. Histologicky dochází v sekrečním endometriu v implantačním oknu ke stromálnímu edému. Tyto známé morfologické změny endometria mohou sloužit jako markery děložní receptivity, ale jejich význam je nejasný.

ADHEZIVNÍ MOLEKULY

Adhezivní molekuly jsou rozděleny do čtyř podskupin: integriny, selektiny, cadheriny a imunoglobuliny. Tyto molekuly se účastní implantace blastocysty i cyklické přestavby endometria.

INTEGRINY

Integriny jsou glykoproteiny, které se skládají z α- a β-řetězce a každý z těchto řetězců je vytvářen jako samostatný protein objevující se v mnoha variantách. Tím vzniká poměrně velké množství (asi 20–24) kombinací výsledných dimerů. Podle stavby jsou také pojmenované, například α1β1 či αIIbβ3. Integriny hrají roli při buněčné interakci s extracelulární matrix. Endometrium tvoří jak integriny přítomné trvale, tak integriny závislé na cyklu. Je známo, že během střední luteální fáze (window of implantation) dochází k poklesu estrogenových a progesteronových receptorů. Pokles progesteronových receptorů je asociován s dočasnou přítomností integrinu αvβ3 na povrchu endometria po 19. dni cyklu [20]. Integrin αvβ3 byl nalezen na povrchu preimplantačního embrya a předpokládá se, že αvβ3 usnadňuje adhezi blastocysty k endometriu. Navíc se předpokládá, že αvβ3 aktivuje a váže metaloproteinázy a aktivátory plazminogenu v extracelulární matrix. Integrin αvβ3 by tak mohl fungovat jako endometriální receptor pro blastocystu, tak i jako facilitátor invaze do trofoblastu. Podle klinických výzkumů se jeví integrin αvβ3 jako marker děložní receptivity a z dosavadních výsledků vyplývá, že jeho přítomnost je snížena u endometriózy [17], poruch luteální fáze [18], idiopatické sterility [19] a při přítomnosti hydrosalpingů [24].

MUCINY

Muciny jsou také glykoproteiny, které se ve velkých koncentracích nacházejí ve sliznicích. U lidí byla prokázána zvýšená přítomnost mucinu MUC-1 v období implantačního okna [12]. Předpokládá se, že MUC-1 může regulovat adhezi blastocysty a ta pak v místě implantace usnadňuje adhezi, zatímco endometrium v jiné oblasti implantaci neumožní [23]. Jiným mucinem, který by mohl být markerem receptivity, je MAG (mouse ascites Golgi) [15]. MAG se objevuje na luminálním endometriu 18.–19. den cyklu. Abnormální exprese byla prokázána u některých pacientek s idiopatickou sterilitou.

ROLE RŮSTOVÝCH FAKTORŮ A CYTOKINŮ

Růstové faktory a cytokiny jsou peptidy a proteiny s parakrinní, autokrinní a endokrinní aktivitou, které se vyskytují v endometriu a podléhají cyklickým změnám v endometriu. Ze skupiny epidermal growth factor (EGF) se na myších modelech prokázala exprese heparin-binding EGF (HB-EGF) kolem blastocyst před implantací. HB-EGF zřejmě stimuluje růst blastocysty a hatching in vitro cestou receptorů EGF na povrchu blastocysty [5]. Dalším faktorem je colony stimulating factor-1 (CSF-1), který je přítomen v lidském endometriu v období implantace a nacházíme ho také v decidui v I. trimestru gravidity [1]. Receptory pro CSF byly nalezeny na embryích před implantací [26].

Leukemia inhibitory factor (LIF) je glykoprotein, který je u žen přítomen v maximální koncentraci ve střední a pozdní sekreční fázi v glandulárním a luminálním endometriu. LIF se zdá moduluje cytotrofoblast. Klinické studie prokázaly, že abnormální exprese LIF v endometriu je spojena se sterilitou a byly také nalezeny mutace genu pro LIF přítomné u sterilních pacientek [13].

Interleukin-1 (IL-1) je glykoprotein ze skupiny cytokinů. V organismu se vyskytuje ve dvou formách, IL-1α a IL-1β, které však nemají zcela shodné biologické funkce. Celý systém IL-1 je exprimován v lidském endometriu. Ke zvýšené koncentraci IL-1 receptorů dochází ve střední luteální fázi [30]. I lidská preimplantační embrya vykazují přítomnost IL-1 systému. IL-1 systém, jak se zdá, hraje specifickou roli v up-regulaci endometriálního β3 integrinu [28].

TROFOBLASTICKÁ INVAZE

Po adhezi blastocysty následuje penetrace trofoblastu přes luminální membránu, poté proniká přes bazální membránu a pokračuje invaze do endometriálního stromatu, kde vniká do maternálních cév se vznikem hemochoriální placenty. Přítomnost blastocysty iniciuje deciduální reakci, při které se stromální buňky proliferují a diferencují do specializovaných buněk, které jsou schopny zajistit nutriční potřeby embrya a hrají řídící roli v invazi embrya do stromatu. Tato reakce může být experimentálně navozena traumatem endometria. Uchycení trofoblastu k extracelulární matrix (ECM) je zprostředkováno adhezivními molekulami. Změny integrinů na membráně trofoblastu signalizují změny cytotrofoblastu do jeho invazivní formy [4]. Proteolýza v ECM je dalším z klíčových momentů invaze během implantace. Cytotrofoblast během prvního trimestru vytváří specifické matrix-degradující enzymy, jako je matrix metaloproteináza MMP-2a MMP-9, které později degradují laminin typ IV collagen rich bazální memránu [3]. Aktivita proteináz je inhibována specifickými inhibitory, které produkuje jak decidua, tak trofoblast, a je jich popsána celá řada. ECM proteiny hrají také významnou roli v implantaci. Decidualizované endometriální stromální buňky vytváří laminin a fibronektin. Laminin zřejmě umožňuje invazi [21]. Naopak fibronektin působí inhibičně na invazi cytotrofoblastu. Mezi dalšími faktory, které inhibují invazi, je např. inzulin qrowth factor binding protein-1 (IGFBP-1).

TROMBOFILIE A IMPLANTACE

Předpokládá se, že k rekurentnímu selhání implantace dochází podobnými mechanismy jako při opakovaných těhotenských ztrátách. Byla prokázána spojitost mezi některými dědičnými formami trombofilií, jako je mutace faktoru V Leiden, mutace faktoru II G20210A, deficit proteinu S a C a u antifosfolipidového syndromu. V úvahu přichází porucha prokrvení endometria, která může vést k poruše receptivity endometria a zároveň i k potratu. Existují práce několika autorů, kteří sledovali význam vrozených trombofilních mutací a získaných trombofilií. Tito autoři však hodnotili pacientky s rekurentním selháním implantace, u kterých se vyskytovaly i další rizikové faktory, jako například onemocnění štítné žlázy [2, 31, 32]. Ačkoli z těchto studií nelze identifikovat trombofilie jako jednoznačnou příčinu selhání implantace, podařilo se prokázat, že protrombotické stavy se ve srovnání s kontrolami vyskytují častěji u pacientek s rekurentními poruchami implantace. Dostupná literatura zabývající se tématem výskytu trombofilií a opakovanými neúspěchy IVF je velmi heterogenní. Di Nisio et al. identifikovali v metaanalýze iniciálně 692 studií, z nichž jen 33 splnilo dostupná kritéria. Ve výsledku autoři zastávají stanovisko, že význam trombofilních mutací u pacientek s RIF zůstává neprůkazný [6]. Část autorů dokládá, že u pacientek s opakovaným selháním implantace a prokázaným výskytem trombofilií použití LMWH signifikantně zvyšuje počet implantovaných embryí, implantation rate (IR), a také počet klinicky prokázaných těhotenství, clinical pregnancy rate (CPR) [33].

Grandone et al. prokázal, že přítomnost trombofilních mutací nemá vliv jen na opakované těhotenské ztráty, ale i na RIF. Je však nutné podotknout, že soubor sledovaných pacientek je malý [11]. Ve vyšetřované skupině čítající 18 pacientek, které podstoupily tři IVF pokusy s fetální ztrátou nebo se selháním implantace, bylo prokázáno signifikantně vyšší procentuální zastoupení pacientek s přítomností trombofilií. Mutace faktoru V Leiden u dvou žen (11 %), faktor II G20210A u tří pacientek (16,6 %), kombinace obou mutací byla přítomna u 5 pacientek (27,7 %). V kontrolní skupině 24 pacientek, které podstoupily 1. nebo 2.IVF cyklus, a skupině 216 žen, které otěhotněly spontánně, byl prokázán faktor V Leiden u čtyř žen (1,9 %), faktor II G20210A u devíti pacientek (4,1 %), kombinace obou mutací celkem u třinácti vyšetřených (6 %).

V další studii se Fatini et al. zaměřili na přítomnost trombofilních mutací u párů s nejasnou příčinou sterility. Jednalo se o klinicky kontrolovanou studii se zaměřením na průkaz trombofilních mutací v souvislosti s příčinou sterility [10]. Celkem do studie zařadili 930 sterilních pacientek, které byly rozděleny do tří skupin. Skupina A: 230 žen s nejasným faktorem sterility, skupina B: ženský faktor sterility – 195 žen (tubární faktor, endometrióza, anovulační cykly), skupina C: mužský faktor sterility – 283 žen. U zbývajících pacientek byl diagnostikován více než jeden faktor sterility. Ve skupině s nejasným faktorem sterility byla přítomnost trombofilií signifikantně vyšší než u kontrolní skupiny. Nebyla však signifikantně vyšší než ve skupině B a C. Nebyla tedy prokázána signifikantně vyšší prevalence trombofilií ani v jedné ze skupin A, B, C. Při porovnávání jednotlivých trombofilních mutací se prokázal vyšší výskyt protrombinové mutace ve skupině s nejasným faktorem sterility (A). Prevalence faktoru V Leiden a antikoagulačních proteinů byla vyšší ve skupině s nejasným faktorem sterility, nejednalo se však o statisticky významný rozdíl.

HEPARIN A IVF

Heparin ovlivňuje fyziologické procesy nutné pro adhezi blastocyst, její implantaci a invazi do trofoblastu, a tím zlepšuje těhotenské výsledky. Bylo prokázáno, že heparinoidy mají regulační efekt na HB-EGF a IGFBP, přičemž oba hrají významnou roli v modulaci implantace embrya a jeho invazi do trofoblastu a také v časných fázích vývoje embrya. Kromě antikoagulačních vlastností heparin také příznivě působí na implantaci embrya skrze interakci s adhezivními molekulami, růstovými faktory, cytokiny a enzymy jako MMP. Heparin také moduluje decidualizaci lidských endometriálních stromálních buněk díky produkci IGFBP-1 a prolaktinu. Heparin má i imunomodulační vlastnosti účinkující přes E-cadherin systém nebo cestou HB-EGF nebo přes indukci volného IGFBP. Ahezivní molekuly, jako je E-cadherin, a růstové faktory, jako IGFBP, byly popsány jako faktory významné pro receptivitu endometria, adhezi blatostocyst a invazi trofoblastu. Heparin může redukovat tvorbu E-cadherinu, a tím působit na invazi trofoblastu. HB-EGF je přítomen v období maximální receptivity endometria, a může tak hrát významnou roli v adhezi a implantaci embrya. Heparin zvyšuje koncentraci jak HB-EGF, tak IGFBP, a proto se předpokládá, že by měl hrát významnou roli v implantaci.

V současnosti nejobsáhlejší přehled dostupných studií publikovala Seshadri et al., která se zaměřila na efekt podání nízkomolekulárního heparinu [27]. Bylo analyzováno 10 studií, zahrnujících celkem 1949 IVF cyklů. Jednalo se o pět randomizovaných kontrolovaných studií a pět prospektivních studií. V randomizovaných stu-diích, ve kterých byl sledovaným výsledkem počet živě narozených dětí (live birth ratio, LBR), nebyl statisticky signifikantní vzestup ve srovnání s kontrolami. V těchto studiích byla patrna tendence ke zvýšení CPR u žen, které si aplikovaly heparin, ale tento trend nedosáhl statistické významnosti. Pouze jediná observační studie prokázala statisticky signifikantní nárůst živě narozených dětí u žen léčených heparinem. Čtyři observační studie prokázaly zvýšení počtu CPR ve skupině s heparinem. U dvou studií, které se zaměřily na ženy s rekurentním selháním implantace, se při aplikaci heparinu neprokázal signifikantní nárůst LBR ani CPR. Počet spontánních potratů po IVF při aplikaci heparinu zůstal nezměněn v randomizovaných i observačních studiích. Ke statisticky významnému snížení potratů nedošlo ani ve skupině RIF. V analyzované podskupině pacientek s prokázanými trombofiliemi ve srovnání s pacientkami bez trombofilií nebyl prokázán signifikantní nárůst CPR ani LBR. V analyzovaných studiích byla značná heterogenita v podávaných přípravcích, dávkování, době zahájení terapie i v délce terapie. Na základě aktuálních literárních dat tedy nelze v současnosti jednoznačně adekvátní terapii definovat.

ZÁVĚR

Jednoznačná spojitost mezi výskytem trombofilií je stále předmětem debat, zdá se, že pacientky s RIF mají častější protrombotické poruchy. Podle dostupných studií by měla být léčba nízkomolekulárním heparinem určena jen pacientkám s prokázaným protrombotickým stavem. U ostatních pacientek nemá žádné opodstatnění. Pacientky s opakovanými poruchami implantace by měly být testovány na přítomnost získaných i vrozených trombofilií a v případě jejich záchytu adekvátně léčeny. Na základě dostupných literárních zdrojů však nelze, vzhledem k heterogenitě studií, stanovit jednoznačně odpovídající dávku LMWH a ani adekvátně stanovit trvání terapie. RIF pacientky, podle literatury, nelze vyčlenit jako skupinu, která by měla profitovat z profylaktické terapie LMWH. Jednoznačnou odpověď na otázku významu aplikace LMWH u RIF pacientek by měly dát další randomizované kontrolované studie.

MUDr. Veronika Lattová

Porodnicko-gynekologická klinika FN

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

e-mail: vlattova@post.cz