K 45: Porcinní model hojení excizní rány experimentálně infikované vícedruhovým bakteriálním biofilmem

Chronické rány představují v klinické praxi závažný problém. Protože tkáň nehojící se rány je ideální prostředí pro mikroorganismy, dochází zde často k přemnožení zejména bakteriálních patogenů a k rozvoji infekce; v důsledku vysoké mikrobiální zátěže je pak proces hojení dále alterován a rána se nachází v perzistující zánětové fázi.

Jsou-li bakterie v chronických ránách přítomné ve vysokém počtu, pak zpravidla přecházejí do biofilmového fenotypu, přičemž v této existenční formě jsou výrazně odolnější vůči působení antimikrobiálních látek i imunitního systému hostitele. To následně výrazně komplikuje možnosti terapie. V současné době je standardem při ošetření biofilmem infikované rány débridement – mechanické odstranění biofilmu a nekrotické tkáně z ran, což je pro pacienty často velmi nepříjemný a bolestivý zákrok. Alternativami k mechanickému débridementu jsou i další postupy jako je například aplikace enzymů, hmyzích larev apod.

I přes značné pokroky ve výzkumu hojení ran však dosud nejsou k dispozici klinicky relevantní in vivo modely, které by umožňovaly věrně simulovat hojení ran infikovaných bakteriálním biofilmem. To samozřejmě omezuje možnosti vyvíjet speciální krytí pro infikované rány či možnosti testovat nové způsoby eradikace biofilmu.

Ideálním modelem hojení ran u člověka je prase, které s člověkem sdílí mnoho podobností v morfologických a fyziologických parametrech, přičemž zejména struktura kůže i mechanismy hojení ran u prasete vykazují v porovnání s člověkem vysokou míru shody. Nicméně, porcinní model rány infikované bakteriálním biofilmem, který by byl použitelný při vývoji prostředků a nových postupů v terapii infikovaných ran v humánní praxi, dosud publikován nebyl.

Naším cílem proto bylo vyvinout model, který bude splňovat následující parametry: 1) rána povleklá bakteriálním biofilmem; 2) signifikantní prodloužení zánětové fáze hojení a oddálení nástupu granulace a 3) možnost sledovat vývoj rány od indukce po zhojení, s frekvencí kontrol a převazů minimálně dvakrát týdně.

Experiment byl realizován na celkem 10 samcích – kastrátech kosteleckého miniprasete (typ minnesota) věku 6–8 měsíců, hmotnosti 43–52 kg. Šest zvířat bylo zařazeno do pokusné infikované skupiny, 4 zvířata byla kontrolní. Všem zvířatům bylo na každé straně v dorsolaterální krajině standardní chirurgickou technikou vytvořeno 5 plnoprofilových excizí zasahujících do subkutánní tukové tkáně. Rány (25x25x5 mm) byly umístěny ve dvou řadách (3 rány v horní řadě, 2 ve spodní). Celý zákrok probíhal v celkové anestezii. V úvodu byla zvířatům i.m. aplikována kombinace azaperon+ketamin, alternativně pak zoletil+tiletamin+xylazin. Po dobu zákroku byla zvířata udržována v anestezii inhalací směsi kyslíku a oxidu dusného (1:2) s 0,5–1,5 % isofluranu. Plynná anestetika byla podávána přes humánní laryngeální masku. Pro mírnění bolesti byla zvířatům po indukci ran po dobu minimálně 1 týden podávána analgetika (tramadol).

Rány kontrolních zvířat byly ihned po indukci kryty sterilním textilním krytím, jehož kontaktní vrstva byla tvořena perforovaným polyetylenem nízké hustoty (LDPE). Do ran pokusných zvířat byl po indukci implantován in vitro „předpěstovaný“ vícedruhový biofilm typu Lubbock, připravený modifikovanou metodou podle Sun et al. (2008) a Dalton et al. (2011). Hlavními složkami kultivačního média pro lubbocký biofilm je Boltonovo médium, krevní plazma a erytrocytární lyzát. V našich experimentálních podmínkách jsme proto používali výhradně autologní krev příjemce, která byla asepticky odebrána 4 dny před indukcí ran punkcí v. metatarsalis plantaris (Klein et Sojka 2012). K implantaci bylo použito cca 500 mg biofilmu na ránu. Celkový počet bakterií v inokulu se pohyboval v rozmezí 108– 109 CFU (kolonie tvořících jednotek) na ránu. Biofilm sestával ze 4 bakteriálních patogenů, izolovaných z chronických ran humánních pacientů: Staphylococcus aureus (cca 10⁵ CFU/mg), Enterococcus faecalis (cca 10⁶ CFU/mg), Bacillus subtilis (cca 10¹ CFU/mg) a Pseudomonas aeruginosa (cca 10⁵ CFU/mg). Po implantaci biofilmu byly rány po celou dobu pokusu kryty stejným způsobem jako u kontrolní skupiny.

Převazy spojené s kontrolou a dokumentací ran byly až do ukončení pokusu prováděny dvakrát týdně, vždy v pondělí a ve čtvrtek. Ve dnech 3, 7, 10, 14 a 24 byly z ran odebrány vzorky biopsií pro mikrobiologické, histologické a molekulárně-biologické analýzy.

Vlastní proces hojení byl sledován na základě fotodokumentace ran a analýzy obrazu (program NIS-Elements AR 3.2). Plochy ran v jednotlivých časových bodech byly vztaženy k ploše rány v den 0 a vyjádřeny v procentech.

Biopsie pro histologické zpracování byly po odebrání zafixovány v 4% paraformaldehydu. Klasickými histologickými metodami z nich byly vytvořeny 4–5 µm silné řezy, které byly obarveny hematoxylinem-eosinem a následně hodnoceny při zvětšení 20–400x.

Pro stanovení mikrobiální nálože byly biopsie odebírány do fyziologického roztoku s peptonem a zchlazeny na 4 °C až do vyšetření (<7 hod.). Použita byla kvantitativní kultivace na selektivních a selektivně diagnostických médiích.

Analyzována byla i genová exprese biopsií z infikovaných a neinfikovaných ran ve všech pěti sledovaných časových bodech. V první fázi byla použita technika microarray. Na základě získaných dat byl vypracován přehled genů významně změněných v infikovaných ránách. Poté bylo přistoupeno k ověření vytipovaných genů pomocí real-time PCR.

Z výsledků vyplývá, že bakteriální biofilm se v ránách udržel po dobu 14 dnů, přičemž proces hojení byl přítomností biofilmu výrazně narušen. V 7. dnu p.i. byla plocha infikovaných ran 79 % oproti 55 % u kontroly; v 10. dnu byly tyto hodnoty 63 % vs. 34 %, ve 14. dnu 43 % vs. 10 %, v 17. dnu 15 % vs. 7 % a v 21. dnu 7 % vs. 4 %.

Dále je patrné, že počet P. aeruginosa a E. faecalis v ráně v sledovaném časovém intervalu pozvolna klesá, narozdíl od S. aureus, který zůstává v ráně v relativně stabilním množství až do dne 14 p.i. B. subtilis se v ráně chová jako kontaminant, který z rány do 14. dne p.i. spontánně vymizel.

Na histologických řezech vytvořených z biopsií odebraných ve 3., 7. a 10. dnu je v infikovaných ránách ve srovnání s kontrolou patrný výrazný reaktivní imunitní infiltrát, který se koncentruje v povrchových vrstvách tukové tkáně a způsobuje nekrózu povrchových tukových buněk. V okolí imunitního infiltrátu je pozorovatelná pouze ojedinělá tvorba granulační tkáně, a to nejdříve 10. den od indukce poranění a v místech, kde se imunitnímu infiltrátu podařilo oddělit „implantovaný“ biofilm od okolní resp. pod ním ležící tkáně. Imunitní infiltrát je tvořen převážně neutrofilními granulocyty a nižším množstvím makrofágů. Na povrchu tukové tkáně je pozorovatelné fibrinové koagulum s koloniemi bakterií biofilmového fenotypu (izolované kolonie bakterií v polysacharidové a fibrinové matrix). Kontrolní rány jsou naproti tomu již v 7. dnu zcela vyplněny granulační tkání, která vykazuje pouze nízkou koncentraci imunitních buněk, omezující se na neepitelizovanou oblast rány. Fibromatózní tkáň v již epitelizované části rány začíná maturovat. Ve 14. dnu je defekt plně vyplněn fibromatózní tkání i u zvířat infikované skupiny, nicméně novotvořená tkáň vykazuje nižší kvalitu architektury a je charakterizována přítomností velkého počtu tukových kapek. V obou skupinách byla pozorována pokračující migrace lehce hyperproliferativní epidermis, která byla v obou skupinách dokončena do 24. dne od indukce poranění.

Výsledky molekulárně-biologických analýz rovněž potvrzují, že přítomnost bakteriálního biofilmu v ráně prodlužuje zánět až do dne 14 p.i. To ukazuje výrazně zvýšená exprese interleukinu 8 a chemokinu 13. Zvýšená exprese laktoperoxidázy zjevně přispívá k přetrvávajícímu zánětu a k tvorbě reaktivních kyslíkových intermediátů. Nadměrná přítomnost těchto molekul v infikovaných ránách je patrná i z exprese superoxid dismutázy 2. Hostitel bojuje proti infekci mimo jiné i expresí antibakteriálního proteinu S100A7 (psoriasin) a lysozymu. Hojení pravděpodobně narušují i vysoko exprimované matrix metaloproteázy 1, 3 a 13. Naopak je v infikovaných ránách snížena exprese receptoru Tie-1, který se podílí na angiogenezi, a proteinů ECM kolagenu I, lamininu 2 a kontaktinu 3. V průběhu hojení infikovaných ran dochází z hlediska genové exprese k přetrvávajícímu zánětu v pozdějších fázích doprovázeného zhoršenou tvorbou granulační tkáně.

Závěr

Podařilo se vytvořit vysoce relevantní preklinický model hojení rány infikované polybakteriálním biofilmem. Statisticky signifikantní rozdíly v rychlosti hojení mezi 3. a 14. dnem, kdy biofilm v ráně perzistuje, poskytují dostatečný časový prostor pro sledování účinnosti prostředků a terapeutických postupů určených k eradikaci biofilmu v ráně. Účinnost terapie a její vliv na vývoj rány lze na takto koncipovaném modelu posuzovat na základě makroskopického hodnocení ran, mikrobiologických, histologických a molekulárně-biologických analýz bioptického materiálu.