Role membránových transportérů v chemorezistenci karcinomu pankreatu při terapii gemcitabinem

Souhrn

Východiska:

Karcinom pankreatu je jednou z nejzávažnějších forem nádorového onemocnění s velmi vysokou mortalitou, která ho v ČR řadí na čtvrtou příčku v příčinách úmrtí na nádorová onemocnění. Cytostatikum ze skupiny nukleosidových analog –  gemcitabin –  patří v současné době mezi široce užívané preparáty v onkologické léčbě a zejména u karcinomu pankreatu. Existují však významné interindividuální rozdíly ve farmakokinetice a farmakodynamice gemcitabinu, které mohou významně ovlivnit výsledek terapie u takto léčených pacientů. Vznik lékové rezistence výrazně limituje klinické využití gemcitabinu, stejně jako ostatních cytostatik.

Cíl:
V tomto článku jsou shrnuty základní dostupné informace o významných membránových proteinech účastnících se transportu gemcitabinu přes buněčnou membránu a jejich role při vzniku chemorezistence u nádorových buněk pankreatu.

Klíčová slova:
karcinom pankreatu –  membránové transportní proteiny –  ABC přenašeče –  proteiny přenášející nukleosidy –  gemcitabin

Úvod

Karcinom pankreatu (MKN  10 : C.25; OMIM : 260350) je jednou z nejzávažnějších forem nádorového onemocnění s velmi vysokou mortalitou, která ho v ČR řadí na čtvrtou příčku v příčinách úmrtí na nádorová onemocnění (zdroj ÚZIS 2010, www.novis.cz). Etiologie a molekulární patogeneze tohoto onemocnění nejsou stále objasněny. Mezi publikované rizikové faktory patří věk, pohlaví, diabetes, chronická pankreatitida, dietní návyky, kouření a infekce Helicobacter pylori [1,2]. Navíc genetická variabilita genů kódujících enzymy metabolizmu cizorodých látek může rovněž hrát důležitou roli při vzniku a rozvoji této malignity.

Mezi základní prognostické faktory patří stadium onemocnění (staging), provedení radikálního chirurgického výkonu a výkonnostní stav pacienta (performance status) [3].

Molekulárně bio­logické prognostické faktory jsou intenzivně studovány, ale zatím bez uplatnění v klinické praxi [4].

Mutace v genu KRAS jsou přítomny přibližně v 85 % sporadických nádorů pankreatu [4]. Frekvence výskytu KRAS mutací jsou asociovány s kouřením, alkoholem a expozicí organickým rozpouštědlům [5,6]. Tyto mutace lze detekovat již na samém počátku nádorového procesu [7]. Mutace v kodonu 12 působí změnu funkce KRAS proteinu, který setrvává v aktivovaném stavu, a umožňuje tak funkci signálních drah (MAPK, PI3K, NF  kB a RAL  GTP), což vede k zastavení buněčného cyklu v G1 fázi a následné kumulaci pozdějších alterací v dalších genech, jako CDKN2A, TP53 apod. [8]. Studie s využitím inhibice exprese pomocí siRNA poukázaly na zásadní úlohu KRAS při udržení nádorové populace [9,10]. KRAS  negativní tumory vykazují, co se týče přežívání pacientů po radioterapii, lepší výsledky než tumory s přítomnými mutacemi. Analýzou podtypů KRAS mutací u karcinomu pankreatu bylo v souladu s výše zmíněnou studií prokázáno, že na výsledné přežívání nemocných mají vliv zejména mutace cGT, GcT a GaT v kodonu 12 (wild type GGT) [11]. Tumory s mutacemi v kodonu 13 mají menší tendenci k lokální progresi i ke vzdálenému metastazování [12].

Prognóza tohoto onemocnění je vzhledem k mortalitě rovnající se incidenci infaustní. Chemoterapií pokročilého karcinomu pankreatu je dosahováno mediánu přežití jen kolem 5– 8 měsíců. V kontrolních skupinách bez chemoterapie se pohybuje medián přežití pouze mezi 2 a  4 měsíci [3]. Jednou z příčin je pozdní diagnostika tohoto typu onemocnění. Klinické příznaky se objevují až v pozdních stadiích a v době diagnózy je již 50 % pacientů s metastatickým postižením. Jediným dnes potenciálně kurativním přístupem je radikální resekce. S ohledem na pozdní diagnózu a špatný výkonnostní stav nemocných podstupuje radikální výkon jen kolem 15– 20 % pacientů [13]. V adjuvanci i paliativní chemoterapii se uplatňují zejména nukleo­tidové antimetabolity. Dnes je uváděn jako lék první volby gemcitabin (2’,2’  difluordeoxycytidin).

Gemcitabin

Gemcitabin – 2’,2’  difluordeoxycytidin (obr. 1) patří ke druhé generaci nukleosidových analog. K léčbě karcinomu pankreatu je standardně používán preparát Gemzar, který je využíván i při léčbě NSCLC a karcinomu močového měchýře, v druhé linii i pro nádory ovaria a prsu. Přestože je monoterapie gemcitabinem uváděna jako zlatý standard v léčbě pokročilého adenokarcinomu pankreatu (NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: Pancreatic Adenocarcinoma V.1.2009. National Comprehensive Cancer Network), je odpověď na terapii gemcitabinem u nádorových buněk pankreatického duktálního adenokarcinomu v ně­kte­rých studiích uváděna jen 12 % a výsledky léčby mezi jednotlivými pacienty se významně liší. V současnosti je vyvíjena maximální snaha o nalezení prediktivních faktorů odpovědi na léčbu gemcitabinem u pacientů s karcinomem pankreatu a individualizaci léčby. Matsubara et al [14] vytvořili skórovací systém (normogram), který v jejich kohortě 304 pacientů s pokročilým karcinomem pankreatu léčených gemcitabinem dokázal rozlišit vysoce rizikovou skupinu pacientů s krátkým mediánem přežívání do 150 dní (p = 2 × 10^–15). Sledovanými parametry tohoto normogramu byly hladiny α1- antitrypsinu a alkalické fosfatázy v plazmě pacientů, počet leukocytů a performance status.

Chemorezistence je způsobena mnoharůznými, pravděpodobně na sobě nezávislými mechanizmy. Gemcitabin je transportován do intracelulárního prostoru pomocí nukleosidových transportérů [3], naopak transportéry rodiny ABC způsobují jeho eflux ven z buňky [4]. Intracelulárně dochází k jeho metabolické aktivaci. Preparát je fosforylován deoxycytosinkinázou na gemcitabin monofosfát a dále konvertován na dFd  dCDP a dFd  dCTP. Vzniklé metabolity gemcitabin trifosfát a gemcitabin difosfát [15] zodpovídají za vlastní cytostatický efekt léku.

Na fosforylaci gemcitabinu se může podílet i mitochondriální tymidinkináza (TK2). Substrátová specifita TK2 je však pro gemcitabin výrazně nižší než pro přírodní formy nuklesidů.

Metabolická inaktivace probíhá zejména cestou cytidindeaminázy anebo po fosforylaci cestou deoxycytidindeaminázy (DCTD) [16]. DCTD se účastní reakce, při které vzniká 2’  2’ difluordeoxyuridin. Mezi dalšími faktory, které velmi pravděpodobně ovlivňují citlivost, jsou zvýšená oprava DNA a alterace cesty apoptózy [17]. V poslední době je věnováno velké úsilí studiu možností ovlivnění cest buněčné signalizace a úloze genů regulujících buněčný cyklus.

Nukleosidové transportéry

Přestože gemcitabin je hydrofilní látka, pravděpodobně nedochází k jeho významnému průniku přes plazmatickou membránu prostou difuzí. Nukleosidový transport se vyskytuje jako Na⁺- independentní, obousměrný prováděný hENT (human Equilibrative Nucleoside Transporter, označovaný také jako rodina SLC29), nebo jako Na⁺- dependentní, prováděný hCNT (human Concentrative Nu­cleoside Transporter, rodina SLC28). Zatím je známo sedm nukleosidových transportérů, které se dělí do dvou rodin proteinů: SLC29 (SLC29A2, SLC29A3, SLC29A4, známé rovněž jako hENT1, hENT2, hENT3 a hENT4) a SLC28 (SLC28A1, SLC28A2, SLC28A3, také označovány jako hCNT1, hCNT2 a hCNT3) [18,19].

Současný výzkum prokázal, že buňky, které nejsou schopny transportu pomocí těchto proteinů, jsou k inhibici gemcitabinem významně rezistentní. Příkladem je např. inhibice nukleosidových transportérů inhibitory typu dipyridamolu [20].

Gemcitabin je podáván jako i.v. bolus v infuzi trvající cca 30 min, a to první, osmý a patnáctý den 28denního cyklu, nebo jednou týdně po dobu dvou měsíců. Peak v séru dosahuje maximálně 50mM a deaminace způsobí rychlý pokles plazmatické koncentrace, takže v průběhu 2 hod spadne pod hranici stanovitelnosti. Předpoklad, který z toho vyplývá, je, že buňky jsou vystaveny gemcitabinu v signifikantní koncentraci jen krátkou dobu a neúčinný buněčný uptake je s největší pravděpodobností jedním z mechanizmů chemorezistence [20].

Gemcitabinový uptake je zajišťován 4 transportéry: hENT1 =^~ hCNT1 > hENT2> hCNT3 [20]. Ve tkáních pankreatu je exprimován hENT1, hENT2 [19], ale vyskytují se zde i hCNT transportéry (hCNT1, hCNT2, hCNT3), jejichž exprese v nádorových tkáních je velmi variabilní [20]. Hlavní mechanizmus příjmu gemcitabinu buňkou je tedy pravděpodobně zajišťován hENT transportéry, protože aktivita hCNT1 byla demonstrována pouze v ledvinách, játrech, střevu a hCNT3 jen v leukemických buňkách a v buňkách kolorektálního karcinomu [22].

Studie in vitro ukázaly, že gemcitabin je do buněk transportován převážně díky hENT1 transportéru [21] a použití inhibitorů, jako je nitrobenzyl merkaptopurin ribosid či dipyridamol, snížilo více než 20násobně citlivost ke gemcitabinu [20]. Imunohistochemická studie na nádorových tkáních od 21 pacientů s pokročilým karcinomem pankreatu ukázala, že pacienti s expresí hENT1 měli významně delší medián přežití než ti s nízkou expresí či absencí hENT1 (13 vs 4 měsíce, p = 0,01) [23]. Podobné výsledky ukazuje i farmakogenetická studie na 83 pacientech, kdy byla exprese analyzována pomocí PCR. Dle autorů bylo celkové přežívání delší u pacientů s vysokou hladinou transkriptů hENT1 (25,7 vs 8,5 měsíce) [24].

ABC transportéry

Chemorezistence je způsobena mnoha různými, pravděpodobně na sobě nezávislými mechanizmy. Jedním z důležitých mechanizmů je snížená akumulace léčiva v nádorových buňkách způsobená jeho zvýšeným únikem (eflux). Ten je zprostředkován proteiny, které z velké části přísluší k nadrodině ABC transportérů (human ATP binding cassette transporters). K dnešnímu datu bylo v lidském genomu identifikováno 49 různých ABC transportérů. Dělí se do 7 tříd (A  G) na základě sekvenční podobnosti. Prvním popsaným lidským ABC transportérem byl P  glykoprotein (ABCB1) [25]. Následně byl izolován z buněk buněčné linie bronchogenního karcinomu MRP1 (ABCC1) [26]. Ukázalo se, že zejména zástupci rodiny ABCB, ke které se řadí i P  glykoprotein [22] a rodiny ABCC [27], jsou zodpovědné za mnohočetnou lékovou rezistenci, tzv. MDR (multiple drug resistance). Kromě uvedených transportérů lze jmenovat i další transportéry, např. BCRP (ABCG2) [28].

ABCB1 (MDR1, P  glykoprotein)

ABCB1, nazývaný také MDR1 či P  glyko­protein, je nejdéle známý a v současnosti nejlépe prostudovaný zástupce ABC transportérů. Substrátem ABCB1 jsou obecně hydrofobní léky s polyaromatickým jádrem a neutrálním nebo kladným nábojem, např. etoposid, adriamycin, vinblastin [29]. Dříve provedené studie prokázaly, že genetické polymorfizmy v ABCB1 genu jsou důležitou determinantou jeho exprese a funkce [30] a obecně ovlivňují odpověď na farmakoterapii [31]. Dle závěrů japonských studií [32,33] vykazují haplotypy ABCB1 významnější vztah k míře exprese než jednotlivé polymorfizmy. Proto lze předpokládat, že haplotypy mohou lépe určit vztah mezi genotypem a fenotypem tohoto transportéru a velmi pravděpodobně bude tento princip univerzální. Vysoce pozitivní imunohistochemické barvení pro P  glykoprotein bylo nalezeno u 73 % duktálních adenokarcinomů pankreatu (n = 103), přičemž exprese ABCB1 genu byla detekována ve všech vyšetřených tumorech, a to ve zvýšené míře oproti normální tkáni slinivky břišní. Vyšší míra exprese ABCB1 dle autorů významně korelovala s lepší prognózou a byla uvedena do souvislosti s menší bio­logickou agresivitou nádoru. Dále byla nalezena vyšší exprese ABCB1 v dobře diferencovaných nádorech oproti těm hůře diferencovaným [34]. Na tuto studii navázala skupina autorů [35], v jejichž studii bylo 75 % vzorků karcinomu pankreatu imunohistochemicky pozitivních na přítomnost proteinu ABCB1 (n = 63). Pacienti s nízkou či střední expresí proteinu vykazovali delší dobu přežití než pacienti s negativní expresí. Velmi zajímavé bylo, že u případů s vysokým stupněm exprese genu ABCB1 bylo nalezeno kratší přežívání než u těch s nižší expresí [35]. Exprese ABCB1 se tedy projevuje jako obecný fenomén vyskytující se v nenádorové i nádorové tkáni, jehož klinický dopad není stále jasný, a jeví se jako aktuální pro podrobné studium v jednotlivých typech nádorů. Na našem pracovišti již probíhá studium ABCB1 v nádorové tkáni prsu. Mezi první publikované výsledky patří prokázaný vztah mezi jednotlivými polymorfizmy genu ABCB1 a mírou exprese tohoto genu (resp. hladinou transkriptu v nádorech prsu). Výskyt funkčních polymorfizmů navíc koreloval s prognózou onemocnění (stav estrogenních receptorů) [36].

ABCC (MRP) rodina

ABCC rodina zahrnuje 13 členů, přičemž 9 z nich se řadí mezi tzv. multidrug resistence proteins (MRP1- MRP9, resp. ABCC1- ABCC6 a ABCC10- ABCC12). ABCC transportéry jsou integrální membránové proteiny způsobující ATP  dependentní export organických iontů ven z buněk. ABCC1- 6 transportují lipofilní složky konjugované s glutathionem, glukuronátem či sulfátem. Substráty pro ABCC4, ABCC5 a ABCC11 zahrnují také cyklické nukleotidy a nukleotidová analoga [37– 39]. ABCC4 byl navíc identifikován jako kotransportér pro redukovaný glutathion se žlučovými solemi a transportér prostaglandinů a DHEAS (dihydroepiandrosteron  3- sulfát).

Ve zdravé tkáni pankreatu i v duktálním adenokarcinomu jsou exprimovány geny ABCC1- 6 a ABCC10, zatímco gen ABCC12 (kódující protein MRP9) byl prozatím detekován jen v normálním parenchymu slinivky břišní. Exprese ABCC3 proteinu je v nádorových vzorcích zvýšená a koreluje s gradingem nádoru [40]. In vitro studie prokázala, že zvýšená exprese ABCB1 a ABCC1 způsobuje buněčný stres, jehož důsledkem je i zvýšený metabolizmus gemcitabinu a zvýšená vnímavost buněk k jeho působení [22]. Oguri et al [42] prověřili expresi genu ABCC5 na buněčných liniích NSCLC (non small cell lung cancer) a poukázali na korelaci mezi jeho expresí a rezistencí vůči gemcitabinu. Při inkubaci s inhibitorem ABCC5 (zaprinast) dochází ke zvýšení citlivosti buněk (tj. cytotoxicity gemcitabinu), což bylo potvrzeno i užitím si RNA.

Dosud známé údaje o expresi a účincích ABCB1, ABCG2 a ABCC rodiny u nádorů pankreatu jsou shrnuty v tab. 1.

ABCG2 (BCRP –  breast cancer resistance protein)

Podobně jako u ABCB1 vede i v případě genu ABCG1 jeho zvýšená exprese ke vzniku mnohočetné lékové rezistence v nádorových buňkách. ABCG2 je polovičním transportérem a k jeho správné funkci je třeba vytvoření homodimerní nebo oligomerní efluxní membránové pumpy spojením dvou anebo více proteinů [43].

Substrátem pro ABCG2 je řada cytostatik, např. topotekan, irinotekan metotrexát, a většina nukleosidových analog včetně gemcitabinu [44,45]. ABCG2 je exprimován v řadě zdravých tkání včetně slinivky a jeho exprese byla detekována i v nádorových buňkách karcinomu pankreatu [40]. Zhou et al demonstrovali přítomnost tzv. side population cells v buněčné linii PANC  1. Tato buněčná linie měla výrazně vyšší expresi ABCB1 a ABCG2 transportérů, což může významně přispívat k její známé lékové rezistenci. Po třídenní kultivaci s gemcitabinem došlo k nárůstu populace těchto buněk. Autoři usuzují, že se může jednat o kandidátní nádorové kmenové buňky, které se účastní relapsu onemocnění [46].

ABCG2 navíc vykazuje spolu s P  glykoproteinem silnou tendenci k interakcím s klinicky významnými inhibitory kináz včetně erlotinibu [47].

Erlotinib (Tarceva) inhibuje receptor typu 1 pro epidermální růstový faktor (EGFR, známý také jako HER1) mechanizmem selektivní intracelulární inhibice fosforylace EGFR  asociovaných tyrozinkináz, čímž vyvolává změnu proliferační aktivity buněk.

Erlotinib je aktivně transportován do buněk pomocí ABCB1 a ABCG2 transportérů in vitro [48]. V souladu s tímto tvrzením byla i in vivo nalezena vyšší bio­logická dostupnost erlotinibu po perorálním podání u myší, které měly tyto dva transportéry inaktivovány, oproti zvířatům, která měla tyto transportéry aktivní [48].

Závěr

Karcinom pankreatu patří k nádorovým onemocněním s velmi vážnou prognózou a pětiletým přežitím pod 5 %, a to i přes celosvětovou snahu o hledání účinnější léčby, včetně léčby bio­logické. V současnosti se za nejúčinnější dostupnou léčbu považuje kombinovaná terapie: gemcitabin (Gemzar) a erlotinib (Tarceva). Pacienti s pokročilým karcinomem pankreatu léčení touto kombinací dosahují jednoletého přežití až ve 20 % [49].

Chemorezistence je způsobena mnoha různými, pravděpodobně na sobě nezávislými mechanizmy. Nicméně jak u gemcitabinu, tak i u erlotinibu byl in vitro i in vivo prokázán významný vliv membránových transportérů na biologickou dostupnost a účinnost těchto preparátů.

Gemcitabin je transportován do intracelulárního prostoru pomocí nukleosidových transportérů. Transportéry rodiny ABC pak způsobují vypumpování jak gemcitabinu, tak i erlotinibu ven z buňky. Genetické alterace v genech, které kódují transportéry, mohou být u pacientů s karcinomem pankreatu jedním z potenciálních prediktivních faktorů pro individualizovanou chemoterapii.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.
The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.
The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers.

MUDr. Beatrice Mohelníková-Duchoňová
Laboratoře toxikogenomiky
Státní zdravotní ústav v Praze
Šrobárova 48
100 42 Praha 10
e-mail: mohelnikova@szu.cz