Kombinace přístupů imunoprecipitace a hmotnostní spektrometrie v analýze interakčních partnerů ΔNp63

Exprese p63 je nezbytná pro tvorbu epidermis a dalších vrstev epitelu. Je přítomen ve vysokých koncentracích v různých kožních nádorech, podílí se na rakovinném bujení a kontroluje chemosenzitivitu. Identifikace interakčních partnerů p63 je nezbytná pro pochopení celého systému genové regulace řídící vývoj epitelu. Tyto znalosti mohou také pomoci objasnit signální dráhy podílející se na odpovědi lidské kůže poškozené UV zářením. K identifikaci proteinů tvořících komplexy s ∆Np63 byly použity proteomické přístupy. Proteiny byly izolovány imunoprecipitací ∆Np63-specifickou protilátkou a následně analyzovány hmotnostní spektrometrií. Identifikovali jsme 23 proteinů, potenciálních interakčních partnerů ∆Np63, které nebyly nalezeny v kontrolních vzorcích. Získané výsledky budou ověřeny dalšími metodami.

Klíčová slova:
protilátky – p63 – imunoprecipitace – proteomika – hmotnostní spektrometrie – protein-proteinové interakce

Autoři: L. Hernychová ¹; M. Nekulová ¹; D. Potesil ²; E. Michalová ¹; Z. Zdráhal ²; B. Vojtesek ¹; J. Holcakova ¹
Působiště autorů: Regional Centre for Applied Molecular Oncology, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, Czech Republic ¹; Core Facility – Proteomics CEITEC, Masaryk University, Brno, Czech Republic ²
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2012; 25(Supplementum 2): 64-69

Práce byla podpořena granty GA ČR P301/10//P431, GA ČR P206/12/G151 a Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

Obdrženo: 23. 10. 2012
Přijato: 30. 10. 2012

Souhrn

Klíčová slova:
protilátky – p63 – imunoprecipitace – proteomika – hmotnostní spektrometrie – protein-proteinové interakce

Zdroje

1. Yang A, Schweitzer R, Sun D et al. p63 is essential for regenerative proliferation in limb, craniofacial and epithelial development. Nature 1999; 398(6729): 714–718.

2. Parsa R, Yang A, McKeon F et al. Association of p63 with proliferative potential in normal and neoplastic human keratinocytes. J Invest Dermatol 1999; 113(6): 1099–1105.

3. Pellegrini G, Dellambra E, Golisano O et al. p63 identifies keratinocyte stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98(6): 3156–3161.

4. Yang A, Kaghad M, Wang Y et al. p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities. Mol Cell 1998; 2(3): 305–316.

5. Candi E, Dinsdale D, Rufini A et al. TAp63 and DeltaNp63 in cancer and epidermal development. Cell Cycle 2007; 6(3): 274–285.

6. Nylander K, Vojtesek B, Nenutil R et al. Differential expression of p63 isoforms in normal tissues and neoplastic cells. J Pathol 2002; 198(4): 417–427.

7. Cravatt BF, Simon GM, Yates JR 3rd. The biological impact of mass-spectrometry-based proteomics. Nature 2007; 450(7172): 991–1000.

8. Moresco JJ, Carvalho PC, Yates JR 3rd. Identifying components of protein complexes in C. elegans using co-immunoprecipitation and mass spectrometry. J Proteomics 2010; 73(11): 2198–2204.

9. Washburn MP, Ulaszek R, Deciu C et al. Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology. Anal Chem 2002; 74(7): 1650–1657.

10. Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM et al. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis 1999; 20(18): 3551–3567.

11. Zhang N, Li L. Effects of common surfactants on protein digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of the digested peptides using two-layer sample preparation. Rapid Commun Mass Spectrom 2004; 18(8): 889–896.

12. Craig AL, Holcakova J, Finlan LE et al. DeltaNp63 transcriptionally regulates ATM to control p53 Serine-15 phosphorylation. Mol Cancer 2010; 9: 195.

13. Harlow E, Lane D. Antibodies, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory: New York; 1988: 522–523.

14. Wisniewski JR, Ostasiewicz P, Mann M. High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers. J Proteome Res 2011; 10(7): 3040–3049.

15. Wisniewski JR, Zougman A, Nagaraj N et al. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods 2009; 6(5): 359–362.

16. UniProt.org [online]. The Universal Protein Resource. UniProt Consortium; 2002–2012 [cit. 2012 October 29]. Available from: http://www.uniprot.org/.

17. Amoresano A, Di Costanzo A, Leo G et al. Identification of DeltaNp63alpha protein interactions by mass spectrometry. J Proteome Res 2010; 9(4): 2042–2048.