Izoenzýmy alkalickej fosfatázy v diagnostike intrahepatálnej cholestázy gravidných

Souhrn

Intrahepatálna cholestáza gravidných je reverzibilná forma cholestázy, vyskytujúca sa v druhej polovici gravidity a pretrvávajúca až do pôrodu. V porovnaní s nekomplikovaným priebehom gravidity sú u žien s intrahepatálnou cholestázou celkové aktivity alkalickej fosfatázy (ALP) obvykle vyššie, avšak majú len malú diagnostickú hodnotu. Jedným z dôvodov pre nízku diagnostickú hodnotu vyšetrenia celkovej aktivity ALP u gravidných žien je fyziologické zvýšenie aktivity ALP v priebehu gravidity ako dôsledok prítomnosti placentového izoenzýmu ALP. Cieľom našej štúdie bolo vyhodnotiť možnosť zvýšenia senzitivity vyšetrenia ALP u pacientok s ICP pomocou vyšetrenia izoenzýmov ALP. Ako ukázali výsledky našej práce, vyšetrenie izoenzýmov ALP zvyšovalo senzitivitu vyšetrenia ALP u žien s touto hepatálnou komplikáciou gravidity (69 % pozitívnych výsledkov v prípade vyšetrenia izoenzýmov ALP v porovnaní s 46 % pozitívnych výsledkov v prípade vyšetrenia celkovej aktivity ALP) (tab. 2, obr. 4 [9]).

Kľúčové slová:
intrahepatálna cholestáza gravidných, alkalická fosfatáza, izoenzýmy alkalickej fosfatázy, sérová hladina žlčových kyselín

Aj fyziologická gravidita predstavuje zvýšenú záťaž pre organizmus matky. Jej priebeh môže byť u časti žien komplikovaný poruchou funkcie rôznych orgánov. Jedným z nich je aj pečeň. Už počas fyziologickej gravidity nastávajú nešpecifické reaktívne zmeny v pečeni matky, ako napr. aktivácia Kupferovych buniek, proliferácia žlčovodov a hladkého endoplazmatického retikula. Spolu so zvýšenou hepatálnou syntézou a sekréciou cholesterolu, narastá aj litogénny index žlče. Pri laboratórnom vyšetrení nachádzame znížené sérové hladiny albumínu, cholínesterázy, naopak zvyšuje sa aktivita alkalickej fosfatázy, stúpa hladina alfa- a beta - globulínov, fibrinogénu, cholesterolu a triacylglycerolov.

Intrahepatálna cholestáza gravidných (ICP) je reverzibilná forma cholestázy objavujúca sa v druhej polovine gravidity a pretrvávajúca až do pôrodu. Predpokladá sa, že ide o geneticky podmienenú poruchu biliárnej exkrécie zhoršovanú estrogénmi. Jej incidencia v Europe sa pohybuje okolo 10-150 prípadov na 10 000 gravidít [1]. Cholestáza ustupuje bez následkov v priebehu prvého mesiaca po pôrode. U postihnutých žien je však častejší výskyt potratov a predčasných pôrodov a stúpa perinatálna úmrtnosť [1,2].

Ako najcitlivejšie vyšetrenie pri diagnostike ICP sa ukázalo vyšetrenie plazmatickej hladiny žlčových kyselín [1,4]. Bežné rutínne hepatálne testy ako sú vyšetrenia aktivít aminotransferáz (ALT a AST), alkalickej fosfatázy (ALP) a gamaglutamyltransferázy (GMT) majú signifikantne nižšiu senzitivitu [1,5]. Vyšetrovanie plazmatickej hladiny žlčových kyselín v našich podmienkach zatiaľ nepatrí do štandardnej ponuky vyšetrení klinicko - biochemických laboratórií. Aktivita alkalickej fosfatázy, ktorá patrí medzi štandardné markery cholestázy, je fyziologicky zvýšená počas gravidity v dôsledku produkcie placentového izoenzýmu, čo sťažuje jej použitie na diagnostiku prítomnosti cholestatickej poruchy.

V našej práci sme chceli zistiť, či vyšetrenie izoenzýmov ALP nezvýši senzitivitu stanovenia ALP pri rutínnom biochemickom vyšetrení u žien s podozrením na ICP.

Pacienti a metódy

Vyšetrovaný súbor tvorilo 39 gravidných žien vo veku 22-37 rokov (priemerný vek 27,9 ± 1,8), u ktorých bola na základe klinickej symptomatológie a vyšetrenia hladiny celkových žlčových kyselín v sére stanovená diagnóza intrahepatálnej cholestatickej hepatopatie (ICP). Kontrolný súbor tvorilo 30 gravidných žien bez známok tehotenských komplikácií, a u ktorých sa v anamnéze nevyskytovalo ochorenie pečene. Druhý kontrolný súbor tvorilo 25 negravidných žien bez anamnestických údajov o ochorení pečene. Hladinu celkových žlčových kyselín v sére sme stanovovali enzymaticky s použitím diagnostickej súpravy BILE ACIDS kit 450-A (SIGMA Chemicals, St .Louis, Mo, USA). Metóda je založená na oxidácii žlčových kyselín pomocou 3α - hydroxysteroid dehydrogenázy. Ako štandardy sme používali Bile Acids calibrator (SIGMA Chemicals, St.Louis, Mo, USA). Štandardne vyšetrované hepatálne vyšetrenia (GMT a celková alkalická fosfatáza) boli vyšetrované komerčnými diagnostickými súpravami podľa návodu výrobcov. Izoenzýmy alkalickej fosfatázy sme stanovovali na základe rozdielnej tepelnej stability [6]. Inkubáciou 10 minút pri 65°C sme inhibovali tkanivovo - nešpecifický izoenzým (hepatálny a kostný). Výsledky boli spracované štatistickým programom Statgraphics.

Výsledky

Do súboru žien s ICP boli pacientky zaradené na základe klinickej symptomatológie a plazmatickej hladiny žlčových kyselín. Plazmatická koncentrácia celkových žlčových kyselín v súbore našich pacientok s ICP bola 25,53 ± 5,32 μmol.l^-1. Vzhľadom na skutočnosť, že ani u jednej z pacientok neprekročila hladina žlčových kyselín hodnotu 40 μmol.l^-1, jednalo sa u všetkých pacientok o miernu formu ICP. V oboch kontrolných súboroch – zdravých gravidných a zdravých negravidných žien boli hladiny žlčových kyselín v rámci referenčných hodnôt, tj. do 10 μmol.l^-1 (5,38 ± 0,98 μmol.l^-1, resp. 4,81 ± 1,02 μmol.l^-1). Priemerná aktivita gamma - glutamyltransferázy sa v súbore pacientok s ICP štatisticky významne nelíšila od aktivity v oboch kontrolných súboroch, pričom v súbore gravidných žien s ICP bolo len 7 pacientok (18 %), u ktorých hodnota GMT prekračovala hornú hranicu referenčného rozsahu (0,14-0,68 μkat.l^-1). Aktivita celkovej alkalickej fosfatázy bola v súbore pacientok s ICP štatisticky významne vyššia ako u zdravých gravidných žien (5,76 ± 3,67 μkat.l^-1 vs 3,04 ± 0,90 μkat.l^-1), pričom hodnoty zvýšené nad hornú hranicu referenčného rozsahu sme zaznamenali u 46 % pacientok. Vyšetrenie tkanivovo - nešpecifického izoenzýmu ALP ukázalo signifikantne vyššie aktivity u žien s ICP v porovnaní so zdravými gravidnými ženami (4,64 ± 2,65 μkat.l^-1 vs. 1,38 ± 0,29 μkat.l^-1), pričom aj podiel patologických hodnôt (hodnôt prekračujúcich hornú hranicu referenčného rozmedzia) bol v súbore žien s ICP vyšší ako v prípade celkovej aktivity ALP (69 % vs. 46 %). Pri hodnotení vzťahu medzi hladinou žlčových kyselín a celkovou aktivitou ALP ako aj aktivitou tkanivovo-nešpecifického izoenzýmu ALP v sére zdravých gravidných žien nebola zistená signifikantná korelácia. V súbore žien s ICP sa však ukázala medzi týmito dvoma parametrami štatisticky signifikantná pozitívna korelácia. Táto bola vyššia v prípade izoenzýmu ALP (P < 0,01, korelačný koef. 0,835 pre tkanivovo - nešpecifický izoenzým ALP vs. P < 0,05, korelačný koef. 0,532 pre celkovú aktivitu ALP).

Diskusia

Alkalická fosfatáza je hydrolytický enzým, ktorého aktivita v krvnom sére je tvorená skupinou izoenzýmov. V súčasnosti sú známe v užšom slova zmysle len tri izoenzýmy ALP – tkanivovo - nešpecifický, intestinálny a placentový. Tzv. tkanivovo-nešpecifický izoenzým, prítomný skoro vo všetkých tkanivách a orgánoch človeka, je kódovaný génom lokalizovaným na krátkom ramene chromozómu č.1 [7]. Napriek tomu, že tkanivovo-nešpecifický izoenzým nachádzajúci sa v rôznych orgánoch ľudského tela je kódovaný tým istým génom, majú jeho jednotlivé formy z rôznych orgánov odlišné vlastnosti. Táto odlišnosť je podmienená rozdielnou glykozyláciou jednotlivých foriem, ktorá nastáva v rámci posttranslačných úprav molekuly enzýmu. Za fyziologických okolností sa na celkovej aktivite ALP v krvnom sére dospelého človeka podieľajú zhruba rovnakým dielom kostná a pečeňová izoforma ALP. Jednou zo základných indikácií vyšetrovania sérovej aktivity ALP sú cholestatické hepatopatie, ktoré podmieňujú signifikantný vzostup aktivity tohto enzýmu. Preto sa ALP spolu s gamma-glutamyltransferázou a leucín-aminopeptidázou zaraďujú medzi tzv. cholestatické enzýmy.

Základným problémom vyšetrovania enzýmovej aktivity ALP u gravidných žien je prítomnosť placentového izoenzýmu ALP v krvi, ktorý spôsobuje fyziologické zvýšenie celkovej aktivity ALP v sére gravidných žien. Významnejší nárast sérovej aktivity ALP nastáva po 20. týždni gravidity a má logaritmický charakter [8]. Toto sa potvrdilo aj v našom súbore zdravých gravidných žien, kde bola aktivita ALP signifikantne vyššia ako v sére negravidných žien. Vďaka zvýšeniu aktivity hepatálnej izoformy bola u žien s ICP aktivita celkovej ALP signifikantne vyššia ako v kontrolnom súbore zdravých gravidných žien, avšak percentuálny podiel pacientok, u ktorých bola aktivita ALP v zóne patologických hodnôt (hodnota nad hornou hranicou referenčného intervalu) bol relatívne nízky (cca 46 %). Senzitivita vyšetrenia celkovej aktivity ALP z hľadiska diagnostiky ICP bola teda pomerne nízka. Snažili sme sa zistiť, či vyšetrenie izoenzýmov ALP nezvýši záchytnosť tejto hepatálnej komplikácie gravidity. Placentový izoenzým ALP sa vyznačuje výraznou termostabilitou (odolnosť voči zahriatiu na 65 oC), čo sa využíva pri jeho stanovení. Túto termostabilitu placentovej ALP sme využili aj v našej práci. Stanovovali sme aktivitu ALP v natívnom sére a po jeho zahriatí na 65 oC. Rozdiel týchto dvoch aktivít predstavuje aktivitu tkanivovo-nešpecifického izoenzýmu ALP. Pri porovnaní aktivity termicky inhibovanej frakcie ALP u žien s fyziologickým priebehom gravidity a u žien s ICP bol rozdiel signifikantne vyšší ako pri porovnaní celkových aktivít ALP. Percentuálny podiel hodnôt presahujúcich hornú hranicu referenčného rozsahu sa v súbore žien s ICP zvýšil zo 46,15 % (pre celkovú aktivitu ALP) na 69,23 %. To znamená, že vyšetrenie izoenzýmov ALP je citlivejším parametrom ako vyšetrenie celkovej aktivity ALP. Skutočnosť, že zvýšenie aktivity tkanivovo-nešpecifického izoenzýmu ALP u žien s ICP je podmienené zvýšením pečeňovej izoformy ALP podporuje hodnotenie vzťahu medzi hladinou žlčových kyselín a aktivitou izoenzýmu ALP. Zatiaľ čo u zdravých gravidných žien sme nenašli signifikantnú koreláciu medzi týmito dvoma laboratórnymi parametrami, u žien s ICP sa ukázala štatisticky významná pozitívna korelácia medzi aktivitou tkanivovo-nešpecifického izoenzýmu ALP a hladinou žlčových kyselín v sére (P < 0,01).

Vyšetrenie aktivity ďalšieho „cholestatického enzýmu“, ktorým je gama-glutamyltransferáza, ukázalo jeho malú diagnostickú hodnotu pri tomto type hepatálneho poškodenia. Percentuálny podiel pacientok s ICP, ktoré mali patologické hodnoty GMT sa pohyboval len okolo 18 %. Tento nález nízkej pozitivity vyšetrenia GMT v našom súbore pacientok s ICP je v zhode s údajmi v literatúre [1,9] ako aj s našimi predchádzajúcimi výsledkami [5].

Najvhodnejším laboratórnym parametrom používaným v diagnostike ICP sa ukazuje stanovenie hladiny žlčových kyselín. V našich podmienkach to však predstavuje problém, pretože vo väčšine klinicko-biochemických laboratórií nepatrí vyšetrenie sérovej hladiny žlčových kyselín medzi štandardné laboratórne vyšetrenia (hlavne z ekonomických dôvodov). Na základe našich výsledkov sa ukazuje, že použitie vyšetrenia izoenzýmov ALP môže zvýšiť diagnostickú citlivosť vyšetrenia celkovej aktivity ALP a tak zvýšiť záchytnosť pacientok s touto hepatálnou komplikáciou gravidity.

prof. MUDr. Ladislav Turecký, CSc.^1,4

MUDr. Ľubomír Divéky, CSc.³

prof. MUDr. Viera Kupčová, CSc.²

¹Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie LFUK

²III. interná klinika LFUK

³II. gynekologicko-pôrodnícka klinika LFUK Bratislava

⁴Alpha medical a.s. – Inštitút laboratórnej diagnostiky, Ružomberok