Hodnotenie aktivity 11β- hydroxysteroid dehydrogenázy typu 1 u pacientiek s reumatoidnou artritídou

Souhrn

Úvod:
U pacientov s reumatoidnou artritídou (RA) sa predpokladá relatívne nízky účinok kortizolu vzhľadom k prebiehajúcemu chronickému zápalu. Jedným z možných mechanizmov môže byť znížená enzýmová aktivita 11β- hydroxysteroid dehydrogenázy typu 1 (11BHSD1), ktorá sa podieľa na premene neaktívneho kortizónu na aktívny kortizol. Cieľom pilotnej štúdie bolo posúdiť aktivitu 11BHSD1 na systémovej a lokálnej úrovni u pacientiek s RA.

Súbor nemocných:
Súbor tvorilo 6 pacientiek s RA bez glukokortikoidnej terapie (vek 29 ± 2 rokov, BMI 21 ± 1 kg. m^– 2) a 6 zdravých žien (vek 30 ± 2 rokov, BMI 21 ± 1 kg. m^– 2). Endogénna produkcia kortizolu bola potlačená podaním dexametazónu. Aktivita 11BHSD1 sa sledovala ako zmena v koncentráciách celkového plazmatického, voľného plazmatického, slinného a tkanivového kortizolu v podkožnom tuku po podaní 25 mg kortizón acetátu per os.

Výsledky:
Podanie kortizón acetátu u pacientiek s RA aj u zdravých kontrol viedlo k signifikantnému vzostupu celkového plazmatického, voľného plazmatického, slinného a tkanivového kortizolu. Odpovede kortizolu však boli porovnateľné u oboch skupín.

Záver:
Napriek chronickému zápalovému procesu majú pacientky s RA nezmenenú konverziu kortizónu na aktívny kortizol, čo naznačuje, že systémová aktivita 11BHSD1 pravdepodobne nezodpovedá za neadekvátne nízke hladiny kortizolu u RA. Nemožno však vylúčiť zmeny aktivity tohto enzýmu v tkanive postihnutom zápalovým procesom.

Kľúčové slová:
reumatoidná artritída –  11β- hydroxysteroid dehydrogenáza typu 1 –  relatívna adrenálna insuficiencia –  kortizol

Úvod

Narastajúci počet štúdií poukazuje na význam nedostatočnej glukokortikoidnej (GK) signalizácie v patogenéze ochorení vyvolaných chronickým stresom [1]. Ide o poruchu, kedy odpoveď glukokortikoidov nie je primeraná záťažovej situácii a nepostačuje na jej primerané zvládnutie, aj keď sú tieto hormóny v cirkulácii zvýšené. Nedostatočný účinok vzniká následkom ich nedostatočnej produkcie (hypokortikalizmus), alebo na bunkovej úrovni následkom zníženej odpovede (rezistencia). Ďalšou možnosťou je porucha na úrovni transportu glukokortikoidov k cieľovým receptorom. Jedným z faktorov ovplyvňujúcich dostupnosť steroidov je cytoplazmatický enzým 11β-hydroxysteroid dehydrogenáza.

11β-hydroxysteroid dehydrogenáza je tkanivovo špecifický enzým, ktorý katalyzuje vzájomnú premenu kortizolu a kortizónu. Sú popísané dve izoformy 11β-hydroxysteroid dehydrogenázy, typ 1 a typ 2 [2]. 11β-hydroxysteroid dehydrogenáza typu 1 (11BHSD1) je nízkoafinitná NADPH-dependentná reduktáza v endoplazmatickom retikule, ktorá v podmienkach in vivo katalyzuje premenu neaktívneho kortizónu na aktívny kortizol a amplifikuje tak lokálny účinok GK [3]. 11BHSD1 sa viaže na existenciu nízkoafinitných glukokortikoidových receptorov v tkanivách, v ktorých tieto hormóny hrajú kľúčovú úlohu, napr. v pečeni, svale a tukovom tkanive.

Reumatoidná artritída (RA) je chronické zápalové ochorenie na autoimunitnom podklade. Pacienti s aktívnou formou RA majú mierne znížené alebo normálne cirkadiánne koncentrácie kortizolu napriek zvýšenej koncen­trácii prozápalových cytokínov, ktoré sú významným aktivátorom hypotalamo-hypofýzo-adrenálnej osi [4,5]. To podporuje hypotézu o relatívnej adrenálnej insuficiencii v patogenéze RA [6,7]. V cirkulujúcich leukocytoch RA pacientov sa zistila redukovaná koncentrácia glukokortikoidových receptorov na 50 % [8], pričom tento fenomén nie je možné pripísať hyperkortikalizmu. Hardy et al nezistili rozdiel v expresii glukokortikoidových receptorov vo fibroblastoch synoviálneho tkaniva, kostnej drene a kože za bazálnych podmienok, ani pri odpovedi na podanie cytokínov u pacientov s RA a osteoartrózou [9]. Naopak, v oboch skupinách pacientov pozorovali významný rozdiel v expresii a aktivite 11BHSD1, ktorá vykazovala špecifické zmeny v závislosti od typu bunky ako aj použitého cytokínu. V inej štúdii synoviálne fibroblasty nevykazovali pozitivitu na izoformy 11β-hydroxysteroid dehydrogenázy ani u jedného typu ochorenia. Keďže zápalová aktivita synoviálneho tkaniva u RA na rozdiel od osteoartrózy pozitívne korelovala s reaktiváciou kortizónu na kortizol, autori danej štúdie predpokladajú zvýšenú synoviálnu aktivitu 11BHSD1 [10].

U obéznych pacientov boli zistené zvýšené koncentrácie prozápalových cytokínov TNF-α a IL 6 [11], ktoré môžu mať silný parakrinný alebo autokrinný účinok na expresiu 11BHSD1. Tomlinson et al zistili v prítomnosti TNF-α zvýšenú aktivitu a expresiu 11BHSD1 v subkutánnom a omentálnom tukovom tkanive [12]. TNF-α má výrazný priamy účinok na vývoj adipocytov v zmysle inhibície diferenciácie, čo vedie k apoptóze [13]. Je preto pravdepodobné, že zvýšená expresia 11BHSD1 a následne zvýšená lokálna produkcia kortizolu môže predstavovať regulačný spätnoväzobný mechanizmus voči priamemu pôsobeniu TNF-α pre opätovné nastavenie rovnováhy v tukovom tkanive [12]. Naviac zmeny systémovej aktivity 11BHSD1 by sa mohli podieľať na relatívnej adrenokrotikálnej insuficiencii u pacientov s RA.

Cieľom práce bolo overiť či zvýšené systémové koncentrácie zápalových cytokínov ovplyvňujú systémovú alebo lokálnu aktivitu 11BHSD1 a zároveň zistiť, či zmeny v systémovej aktivite 11BHSD1 prispievajú k relatívnemu nedostatku kortizolu u pacientov s RA.

Súbor a metodika

Súbor tvorilo 6 pacientiek s RA vo veku 29,2 ± 1,7 rokov s BMI 21,0 ± 0,8 kg. m^–2 a kontrolná skupina 6 zdravých žien vo veku 29,5 ± 1,5 rokov s BMI 20,8 ± 1,0 kg. m^–2. Pacientky s RA boli v štádiu remisie, s dĺžkou trvania ochorenia minimálne 2 roky, nefajčiarky, bez GK terapie, s bazálnou liečbou (metotrexát, ochorenie modifikujúca liečba, nesteroidné protizápalové lieky) a bez prítomnosti iného závažného ochorenia okrem RA. Zdravé dobrovoľníčky boli nefajčiarky a nebrali lieky, ktoré by interferovali s neuroendokrinnou funkciou hypotalamo-hypofýzo-adrenálnej osi. Pre vylúčenie gravidity bol u všetkých osôb vykonaný tehotenský test zo vzorky moču. Po oboznámení sa s protokolom vyšetrenia všetky osoby podpísali informovaný súhlas o účasti na štúdii. Protokol štúdie bol schválený Etickou komisiou Národného ústavu reumatických chorôb v Piešťanoch.

Vyšetrenia prebiehali ráno, pričom pacientky aj dobrovoľníčky boli požiadané, aby 12 hod pred vyšetrením nejedli, nepili alkoholické alebo sladené nápoje, minimálne 8 hod spali a vyhli sa stresovým situáciám a väčšej fyzickej námahe. Pacientky s RA užili rannú dávku liekov až po skončení vyšetrenia. Počas celého vyšetrenia pacientky aj dobrovoľníčky ležali na lôžku.

Endogénna produkcia kortizolu bola potlačená podaním 1,5 mg dexametazónu (Dexamethazon Léčiva, Zentiva a.s., Praha, Česká republika) per os v 2 dávkach; 1. dávka 1 mg o 23:00 hod večer pred vyšetrením a 2. dávka 0,5 mg o 8:30 hod ráno. Sledovania začínali o 8:00 hod zavedením intravenóznej kanyly do kubitálnej žily a mikrodialyzačnej sondy s cut off membrány 20 kDa (CMA Microdialysis AB, Solna, Švédsko) paraumbilikálne do podkožného tukového tkaniva. Ako dialyzačný roztok bol použitý Ringerov roztok, pri rýchlosti 0,5 μl/ min sa mikrodialyzát zbieral v hodinových intervaloch. Po 30-minútovej stabilizačnej fáze o 8:30 hod začal bazálny zber mikrodialyzátu, o 9:30 hod sa ihneď po bazálnom odbere krvi, slín a mikrodialyzátu aplikovala dávka 25 mg kortizón acetátu (Cortison CIBA, Novartis Pharma GmbH, Norimberg, Nemecko) per os. Ďalšie vzorky krvi sa odoberali 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180 a 240 min po podaní kortizón acetátu, vzorky slín a mikrodialyzátu v hodinových intervaloch.

Vzorky krvi sa po odbere do polyetylénových skúmaviek s obsahom EDTA (S-Monovette^®, Sarstedt AG, Nümbrecht, Nemecko) ihneď schladili v drvenom ľade a čo najskôr scentrifugovali pri rýchlosti 2 500 otáčok za mi­nútu pri 4 °C. Vzorky plazmy sa zmrazili a uchovali do analýzy pri – 20 °C. Vzorky slín zbierané do polypropylénových nádobiek systému Salicaps (SaliCaps^®, IBL, Hamburg, Nemecko), ako aj vzorky mikrodialyzátu subkutánneho tukového tkaniva zbierané do zberných nádobiek (Microvials, CMA Microdialysis, Solna, Švédsko) boli ihneď zmrazené a uskladnené pri – 20 °C do stanovenia sledovaných parametrov.

Vo vzorkách plazmy sa stanovili hladiny celkového plazmatického kortizolu komerčne dostupným rádioimunoanalytickým kitom (Immunotech S.A., Beckman Coulter Group, Praha, Česká republika). Voľný plazmatickýkortizol sa meral pomocou ekvilibračnej dialýzy s následným použitím imunoanalyzátora Roche Elecsys 2010 [14]. Vo vzorkách slín a mikrodialyzátu sa stanovil slinný a tkanivový kortizol pomocou kitu enzýmovou imunosorbentnou analýzou (IBL GmbH, Hamburg, Nemecko). Maximálna hormonálna odpoveď (Δ_max) bola vypočítaná ako rozdiel maximálnej a východiskovej koncentrácie príslušného hormónu.

Na štatistickú analýzu dát sa použil program SPSS v 11.5 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Porovnanie zmien vybraných parametrov v rámci skupín bolo vykonané párovým t testom. Na hodnotenie rozdielov jednotlivých premenných medzi skupinami sa použila dvojcestná ANOVA pre opakované merania. Výsledky sú uvedené ako priemer ± štandardná chyba priemeru. Za signifikantný rozdiel bola považovaná hladina štatistickej významnosti p < 0,05.

Výsledky

Podanie dexametazónu v celkovej dávke 1,5 mg malo za následok zníženie hladiny celkového plazmatického kortizolu ako aj jeho voľných frakcií v slinách, plazme a mikrodialyzáte podkožného tukového tkaniva takmer až na koncentrácie pod dolným rozsahom citlivosti metód. Supresia hladín celkového plazmatického kortizolu nastala u všetkých sledovaných pacientiek s RA (18,0 ± 4,9 nmol/ l) ako aj u zdravých dobrovoľníčok (14,5 ± 1,7 nmol/ l).

Podanie 25 mg kortizón acetátuu oboch skupín viedlo k signifikantnému vzostupu (p < 0,001) celkového plazmatického kortizolu, pričom rozdiel v maximálnych vzostupoch medzi pacientkami s RA (Δ_max: 469 ± 102 nmol/ l) a zdravými kontrolami (Δ_max: 532 ± 35 nmol/ l) nebol štatisticky významný (p = 0,578) (obr. 1). Pozorovali sa signifikantné vzostupy (p < 0,001) voľných frakcií kortizolu (voľného plazmatického, slinného a tkanivového kortizolu) u oboch vyšetrených skupín. Avšak nenašli sa signifikantné rozdiely v odpovediach celkového plazmatického kortizolu ako aj jeho voľných frakcií, t.j. voľného plazmatického, slinného a tkanivového kortizolu medzi pacientkami s RA a zdravými kontrolami (obr. 1).

Diskusia

Na hodnotenie vplyvu chronického zápalu na aktivitu 11BHSD1 sa v tomto sledovaní využil fakt, že pacienti s RA majú dlhodobo a významne zvýšené zápalové cytokíny. Výsledky našej pilotnej štúdie ukazujú, že pacientky s RA nemajú zmenenú systémovú aktivitu 11BHSD1 ani lokálnu aktivitu v podkožnom tukovom tkanive. Preto môžme predpokladať, že na mechanizmoch relatívnej hypokortizolémie u pacientov s RA sa pravdepodobne nepodieľa zníženie aktivity 11BHSD1. Nemožno však vylúčiť zmeny lokálnej aktivity 11BHSD1 v synoviálnom tkanive postihnutých kĺbov, čo by bolo potrebné overiť in vivo [9,10].

Niekoľko in vivo štúdií u obéznych ľudí hodnotilo aktivitu 11BHSD1 na systémovej úrovni po orálnom podaní kortizón acetátu s predchádzajúcim podaním dexametazónu. Po potlačení endogénnej tvorby kortizolu dexametazónom je premena kortizónu na kortizol ukazovateľom hepatálnej aktivity 11BHSD1 [15,16]. Všetky práce potvrdili zníženú aktivitu 11BHSD1 v pečeni u centrálnej obezity. Ide pravdepodobne o ochranný fyziologický mechanizmus, ktorý vedie k zlepšeniu inzulínovej senzitivity a obmedzuje ďalší nárast telesného tuku [16].

Meranie lokálnej aktivity 11BHSD1 v tukovom tkanive u ľudí je obtiažne. Výsledky in vitro štúdií zaoberajúce sa úlohou 11BHSD1 u obezity nemusia platiť pre patofyziológiu ľudského organizmu [12,17]. Overenie aktivity 11BHSD1 v podkožnom tukovom tkanive in vivo prostredníctvom artério- venózneho rozdielu v sérovej koncentrácii kortizolu a kortizónu jednoznačne nepotvrdilo zmenu aktivity 11BHSD1 u obezity [18]. Naopak použitie mikrodialýzy podkožného tukového tkaniva, ktorej sonda bola premývaná rádioaktívne označeným kortizónom potvrdilo výsledky in vitro štúdií o zvýšenej lokálnej aktivite 11BHSD1 u obéznych osôb [19]. Spomínané štúdie sledovali aktivitu 11BHSD1 na systémovej a lokálnej úrovni u obezity, u ktorej sa predpokladá prítomnosť subklinického zápalu [20,21]. Niektorí autori sa domnievajú, že 11BHSD1 sa podieľa na patogenéze chronického zápalu [9,10]. Práce, ktoré sa zaoberajú danou problematikou in vivo u ľudí chýbajú.

V našej práci po podaní kortizón acetátu došlo k premene neaktívneho kortizónu na aktívny kortizol prostredníctvom enzýmu 11BHSD1 na systémovej a lokálnej úrovni u pacientiek s RA a kontrol. Na systémovej úrovni sa nepozoroval rozdiel v koncentráciách celkového a voľného plazmatického kortizolu medzi oboma skupinami, čo potvrdili aj porovnateľné koncentrácie slinného kortizolu. Podobne na lokálnej úrovni nebol zistený rozdiel v koncentrácii tkanivového kortizolu v podkožnom tukovom tkanive medzi pacientkami a kontrolami napriek zvýšenej systémovej koncentrácii zápalových cytokínov u pacientiek s RA. Tento výsledok je v súlade s inou prácou našej skupiny, kde sa sledovala degradácia kortizolu po intravenóznom podaní u pacientov s RA, kde sa však taktiež nenašiel rozdiel oproti zdravým osobám [22].

Záverom možno konštatovať, že napriek chronickému zápalu majú pacientky s RA nezmenenú konverziu kortizónu na aktívny kortizol, čo naznačuje, že systémová aktivita 11BHSD1 pravdepodobne nezodpovedá za neadekvátne nízke hladiny kortizolu u RA. Nemožno však vylúčiť zmeny aktivity tohto enzýmu v tkanive postihnutom zápalovým procesom.

Poďakovanie

Naša veľká vďaka patrí prof. MU Dr. RNDr. Lu-boslavovi Stárkovi, DrSc., za dlhoročnú spoluprácu. Ďakujeme aj p. Emílii Andelovej za technickú pomoc a asistenciu v laboratóriu.

Táto práca bola podporená grantom MZ 2005/ 20- NURCH- 04 a VEGA 2/ 6157/ 26.

Skratky

11BHSD1 –  11β-hydroxysteroid dehydrogenáza typ 1

GK –  glukokortikoidy

RA –  reumatoidná artritída

MU Dr. Jana Kerlik
www.endo.sav.sk/ slovak.htm
e-mail: jana.kerlik@savba.sk

Doručeno do redakce: 1. 10. 2010