Oxidační stres u pacientů s onemocněním ledvin

Souhrn

Pacienti s chronickým onemocněním ledvin jsou vystaveni oxidačnímu stresu (OS), který se podílí na zhoršení zdravotního stavu. Snížená exkreční schopnost ledvin vede k akumulaci látek s prooxidačními vlastnostmi, které poškozují nejen ledviny, ale celý organizmus, včetně kardiovaskulárního systému. Jednotlivé složky antioxidačního systému hrají významnou roli v eliminaci OS. Právě sledování hladin antioxidantů a produktů OS u těchto pacientů a jejich správná interpretace ve vztahu k funkci ledvin a dalších orgánů, může přispět k zefektivnění jejich léčby a zlepšení zdravotního stavu.

Klíčová slova:
reaktivní formy kyslíku a dusíku – antioxidanty – ledviny – dialýza – transplantace – imunosupresiva

Úvod

U nemocných s chronickým selháním ledvin je pozorován výrazný nárůst incidence kardiovaskulárních komplikací. Incidence kardiovaskulárních onemocnění je přibližně 10–20krát vyšší u nemocných s chronickým selháním ledvin v porovnání s běžnou populací. Kardiovaskulární komplikace jsou příčinou téměř 50–60 % úmrtí pacientů po transplantaci ledviny (TL) [1–4]. Na této skutečnosti se podílí celá řada rizikových faktorů (tab. 1), včetně netradičního rizikového faktoru oxidačního stresu (OS) [5,6].

Volné radikály a oxidační stres

Volné radikály (VR) jsou atomy nebo molekuly, které mají alespoň jeden orbital s jedním nepárovým elektronem. Vznikají ztrátou či přijetím elektronu, což je činí nestabilními a vysoce reaktiv­ními. Radikály se snaží chybějící elektron doplnit nebo odevzdat reakcí s okolními molekulami, čímž dochází k tvorbě dalších radikálů. Řetězová reakce je ukončena, setkají-li se dva VR nebo setká-li se radikál s látkou, jejíž radikál je stabilnější a může přetrvávat delší dobu, aniž by reagoval s další molekulou ve svém okolí [7].

V organizmu vznikají 2 formy reaktivních sloučenin. Jedna forma je odvozena od kyslíku – reaktivní formy kyslíku (ROS) [8], druhá od dusíku – reaktivní formy dusíku (RNS) [9]. Mezi reaktivní formy kyslíku a dusíku (RONS) se řadí nejen VR, ale také sloučeniny, které samy radikály nejsou, ale mohou se podílet na jejich vzniku (tab. 2).

Na vzniku RONS se podílí řada faktorů, které můžeme rozdělit na exogenní a endogenní. Endogenními zdroji radikálů jsou: dýchací řetězec, metabolizmus endogenních a exogenních látek, syntéza prostaglandinů, aktivace bílých krvinek, fagocytóza, autooxidace thiolů, hyperglykemie, ischemie/reperfuze atd. Mezi exogenní zdroje řadíme ionizující a ultrafialové záření, intoxikace kovy, kouření, některá léčiva aj. [10]. K produkci VR přispívají atomy přechodných kovů (železo, měď, nikl, mangan, titan aj.), které, pokud nejsou vázány na bílkovinu, velmi ochotně reagují s peroxidem vodíku za vzniku ROS. Produktem této tzv. Fentonovy reakce je velmi reaktivní hydroxylový radikál (HO^•) (obr. 1). HO^• může reagovat s okolními makromolekulami a poškozovat je. Dalším produktem Fentonovy reakce je hydroxidový anion (OH¯), který je odstraňován činností nárazníkových systémů [10].

RONS jsou pro funkci organizmu nezbytné a prospěšné, protože v nízkých koncentracích hrají roli signálních molekul a zapojují se např. do reakcí imunitního systému. Při infekci jsou součástí obranné mašinerie buňky. Stimulace leukocytů a makrofágů je spojena s aktivací NADPH-oxidázy, která katalyzuje syntézu superoxidového radikálu (obr. 2) [11]. Také radikál oxidu dusnatého (NO^•) tvořený syntázou oxidu dusnatého je nezbytný pro funkci endotelu. Tento radikál však ochotně reaguje se superoxidovým radikálem za vzniku peroxynitritu (ONOO¯), který se podílí na modifikaci proteinů, lipidů a nukleových kyselin. Z peroxynitritu vzniká kyselina peroxynitritová (ONOOH), která se rozkládá na HO^• a radikál oxidu dusičitého (NO₂^•), který oxiduje mastné kyseliny a modifikuje aminokyseliny. Snížení vnitrobuněčné hladiny NO^• reakcí s O₂^•¯ vede k poruchám funkce endotelu a k ateroskleróze. ONOO¯ reaguje snadno s kyselinou chlornou, která je tvořena myeloperoxidázou, a vzniká chlorid nitrylu (NO₂Cl) a NO₂^•, které oxidačně modifikují makromolekuly ve svém okolí [12]. Při vzestupu hladiny RONS dochází ke změně oxidoredukčního stavu buňky a ovlivnění signálních drah, např. signální dráhy řízené komplexem aktin-Keap 1 s jaderným faktorem Nrf2, která řídí syntézu některých antioxidačních enzymů a enzymů 2. fáze [13]. Za normálních fyzio­logických podmínek je mezi produkcí RONS a hladinou antioxidantů udržována rovnováha celou řadou proteinů a nízkomolekulárních látek. Při výrazné nadprodukci RONS dochází ke změnám, které mohou vyústit až ve smrt buňky. Stav způsobený nadměrnou tvorbou RONS a nedostatečnou schopností organizmu odstraňovat reaktivní meziprodukty se nazývá oxidační stres (OS) [14].

Reakce reaktivních forem kyslíku a dusíku s biomolekulami

RONS jsou velice nestabilní a velmi reaktivní a mohou napadnout prakticky jakoukoli molekulu v lidském těle. Nejčastěji dochází k poškození nenasycených mastných kyselin fosfolipidů buněčných membrán (narušení funkce membrán), bílkovin (inaktivace enzymů, poškození transportních molekul, receptorů) a nukleových kyselin (změny genetické informace, mutace).

Lipidy

Poškození mastných kyselin (MK) působením VR nazýváme peroxidace lipidů. Cílem RONS jsou nejčastěji polynenasycené mastné kyseliny (PNMK). V průběhu peroxidace PNMK se vytváří dieny, hydroperoxidy a peroxidy, dochází ke štěpení modifikovaných PNMK a vzniku reaktivních strukturně rozmanitých derivátů uhlovodíků, např. alkanalů (malondialdehydu), alkenolů a jejich hydroxyderivátů (4-hydroxynonenalu) (obr. 3), které je možné sledovat nejen v tělních tekutinách [15], ale i ve vydechovaném vzduchu pacientů léčených dialýzou [16]. K oxidační modifikaci dochází také u lipoproteinů s nízkou hustotou (LDL), které se nazývají oxidované LDL (ox-LDL). Ox-LDL se podílí na poškození cévní stěny a časném stadiu aterosklerózy [17]. LDL částice mohou být také modifikovány kyselinou chlornou. Takto oxidačně modifikované LDL stimulují zánětlivou reakci vedoucí k narušení funkce endotelu [12]. Měření hladiny produktů oxidačního poškození lipidů se velmi často využívá k monitorování OS. Přehled parametrů OS je uveden v tab. 3 [18].

Proteiny

RONS reagují s proteiny a oxidačně je modifikují (modifikace postranních skupin aminokyselin, oxidace SH skupin, zesíťování peptidových řetězců), což má za následek změnu stability proteinů, např. zvýšený sklon k fragmentaci, nebo naopak rezistenci k proteolýze, tvorbě agregátů proteinů a změně jejich funkce [19]. Proteiny modifikované RONS se nazývají produkty pokročilé oxidace proteinů (AOPP) [20]. AOPP lze rozdělit na nízkomolekulární (převážně modifikovaný albumin) a vysokomolekulární (proteiny o velikosti nad 600 kD), které jsou tvořeny agregáty proteinů vznikajících z modifikovaných bílkovin. AOPP mají zvýšenou rezistenci k proteolytickému štěpení a snižují vazodilatační účinek NO^•. AOPP indukují peroxidaci lipidů, syntézu prozánětlivých cytokinů a adhezivních molekul. Mají vysokou afinitu k receptoru pro pokročilé produkty glykace proteinů (RAGE). RAGE jsou exprimovány v ledvinách na povrchu endotelových a mezangiálních buněk a také buněk hladkého svalu a makrofágů. Po navázání AOPP na RAGE je aktivován nukleární faktor κB (NF-κB), což vede ke zvýšené expresi cytokinů, k tvorbě růstových faktorů, adhezivních molekul, syntéze kolagenu IV a fibronektinu a buněčné proliferaci [20,21].

U nemocných s chronickým selháním ledvin je množství oxidačně poškozených proteinů a AOPP výrazně zvýšeno a je považováno za ukazatel OS [22]. Některé bílkoviny, které se hromadí při uremii, se mohou stát základem pro vznik AOPP (např. β₂-mikroglobulin) [23]. U pacientů v hemodialýze byla hladina oxidačně modifikovaných proteinů (karbonylovaných proteinů) signifikantně zvýšená v porovnání se zdravými jedinci [24,25]. Prodlužující se dobou hemodialyzačního léčení se jejich hladina zvyšuje [26]. AOPP mají afinitu k receptoru pro lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL) třídy B typu I, čímž se podílí na sníženém vychytávání cholesterolu a vzniku abnormálních HDL lipoproteinů s proaterogenním účinkem, a tak dochází k zvýšení kardiovaskulárního rizika těchto pacientů [27].

Nukleové kyseliny

RONS poškozují také genetický materiál oxidační modifikací dusíkatých bazí, a to vznikem zlomů řetězců DNA a tvorbou aduktů. Tyto modifikace mohou vést ke změně exprese genů, přestavbě chromozomů, zastavení replikace atd. K odstranění poškozené DNA využívají buňky specifické a nespecifické opravné mechanizmy [28]. Pokud nedojde k opravení poškozené DNA, dochází ke vzniku mutací, což může vyústit až v karcinogenezi [29].

Všechny dusíkaté báze DNA mohou být oxidačně modifikovány. Nejsnáze je oxidován guanin. Reakcí s HO^• vzniká 8-hydroxy-2’-deoxyguanosin (8-OH-dG), který je nejčastějším markerem využívaným pro sledování oxidačního poškození DNA [30]. Herman et al zjistili, že po hemodialýze dochází k nárůstu aktivity reparačních enzymů, což svědčí o schopnosti organizmu odstraňovat oxidačně poškozenou DNA [31]. S modifikací bazí dochází také ke vzniku zlomů v DNA, které je možné sledovat např. v lymfocytech dialyzovaných jedinců citlivou jednobuněčnou gelovou elektroforézou [32–34].

Antioxidační ochrana organizmu

Antioxidační ochrana organizmu, tzv. celková antioxidační kapacita (TAC), je soubor látek – antioxidantů a mechanizmů, které byly v lidském organizmu vyvinuty k odstraňování látek s pro­oxidačními vlastnostmi. TAC je tvořena strukturně různorodými látkami (vysokomolekulární a nízkomolekulární povahy), jejichž vzájemná souhra je nezbytná (tab. 4, obr. 4) [7].

Z vysokomolekulárních antioxidantů mají významnou funkci tyto vybrané enzymy: superoxiddismutáza (SOD), glutationperoxidáza (GPX), kataláza (KAT), glutationreduktáza (GR), glutationtranferáza (GST) a proteiny vázající tranzitní kovy (albumin, transferin, ferritin, laktoferin, haptoglobin, hemopexin, ceruloplasmin, metalothioneiny a další) [35]. SOD má 3 izoformy, a to cytoplazmatickou Cu/Zn-SOD, mitochondriální Mn-SOD a extracelulární SOD (vázaná na buněčné membrány) [36]. Všechny izoformy jsou tvořeny v ledvinách ve vysokém množství [12] a podílejí se na odstraňování superoxidového radikálu za vzniku peroxidu vodíku. Ten má relativně dlouhý biologický poločas a snadno difunduje membránami. Peroxid vodíku je odstraňován enzymy KAT a GPX. KAT ho štěpí na vodu a kyslík, zatímco GPX redukuje peroxid vodíku za současné oxidace redukovaného glutationu (GSH). Aby tento enzym mohl odstraňovat peroxid vodíku, je třeba regenerovat oxidovaný glutation na GSH reakcí katalyzovanou GR. GST katalyzuje především detoxifikační reakce elektrofilních organických látek (např. produktů peroxidace lipidů, 4-hydroxynonenalu) s GSH [35]. Vzájemný vztah antioxidačních enzymů znázorňuje obr. 4. Dalším důležitým antioxidačním mechanizmem, který se podílí na odstraňování ROS, je thioredoxinový systém tvořeným thioredoxinem, thioredoxinreduktázou a peroxiredoxinem. Tyto proteiny se hojně nachází v buňkách ledvinných kanálků. U pacientů se sníženou glomerulární filtrací bylo zjištěno, že se zvyšuje množství thioredoxinu spolu s C-reaktivním proteinem [37].

Z nízkomolekulárních antioxidantů má významný podíl na antioxidační ochraně plazmy (tělních tekutin) kyselina močová, která zajišťuje 35–65 % antioxidační kapacity. VR poskytují reakcí s kyselinou močovou urátový radikál, který je detoxikován reakcí s kyselinou askorbovou, nebo vzniká allantoin, který je považován za marker OS [38]. Kromě toho má kyselina močová schopnost vázat ionty železa a mědi, a tím bránit produkci nebezpečného HO^• Fentonovou reakcí [39]. Paradoxně jsou však pacienti s hyperurikemií vystaveni OS. Kyselina močová má při vysokých koncentracích pro­oxidační a prozánětlivé účinky, stimuluje růst buněk hladkého svalstva, moduluje funkci endoteliálních buněk a přispívá k rozvoji hypertenze a kardiovaskulárních onemocnění [40,41]. U uremických pacientů a pacientů s chronickým onemocněním ledvin, kteří nejsou léčeni hemodialýzou, byly rovněž popsány změny hladiny GSH a antioxidačních enzymů [42,43]. Snížení hladiny kyseliny močové allopurinolem je provázeno zlepšením funkce ledvin u pacientů s chronickým selháním ledvin [44].

K nejdůležitějším intracelulárním nízkomolekulárním antioxidantům patří GSH. Jeho funkcí je odstraňování prakticky všech RONS, udržování sulf­hydrylových skupin proteinů a peptidů v redukované formě, regenerování tokoferolu a askorbátu. GSH je nezbytným substrátem pro enzymatické reakce katalyzované GPX a GST a je regenerován GR. Alhamdani prokázal, že pacienti s uremií mají sníženou hladinu erytrocytárního GSH a zvýšenou hladinu malondialdehydu v porovnání se zdravou populací. Dále zjistil, že dochází k narušení syntézy GSH, protože aktivita klíčových enzymů biosyntézy γ–glutamylcysteinsyntetázy a gluta­tionsyntetázy je snížena. Tyto změny byly pozorovány také u hemodialyzovaných pacientů a pacientů léčených peritoneální dialýzou, i když hladina GSH či aktivity enzymů glutamylcysteinsyntetázy a glutationsyntetázy nebyly jedno­rázovou dialýzou ovlivněny [45].

Poměr redukovaných a oxidovaných thiolů (-SH/-SS-) nízkomolekulárních a vysokomolekulárních látek ovlivňuje redoxní homeostázu v buňce. Změny v poměru -SH/-SS- jsou jedním z důležitých nástrojů, jak buňka reguluje enzymovou aktivitu, expresi proteinů a signální dráhy. K poklesu tohoto poměru dochází při zvýšené produkci RONS při OS. U pacientů s akutním nebo chronickým selháním ledvin bylo zjištěno, že albumin má zvýšené množství oxidovaných SH-skupin a má menší schopnost zapojit se do ochranných dějů buněk ledviny. Současně dochází k akumulaci homocysteinu a cysteinu, které negativně působí na endotel [12].

Stanovení antioxidační kapacity

Změny hladin nízkomolekulárních antioxidantů a změny exprese vysokomolekulárních antioxidantů, včetně aktivity antioxidačních enzymů, vyjadřují schopnost organizmu jako celku vyrovnat se s OS, což se odráží v hodnotách TAC. Stanovení TAC je ve většině případů založeno na schopnosti všech součástí biologického materiálu (nízkomolekulární a vysokomolekulární povahy) neutralizovat radikály, které jsou generovány různými chemickými reakcemi. Hodnota TAC se vztahuje ke standardní látce, kterou je nejčastěji ve vodě rozpustný derivát vitaminu E (6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2-karboxylová kyselina; Trolox). Současně je vhodné provádět stanovení nízko- a vysokomolekulárních antioxidantů a prooxidantů pro monitorování OS. Tato stanovení jsou založena na fyzikálně-chemických vlastnostech těchto látek a využívá se celé řady laboratorních metodik [46,47]. Pro posouzení OS je vhodné stanovovat několik parametrů, jak antioxidační povahy, tak produktů OS, aby bylo možné získané výsledky co nejlépe interpretovat [48,49].

Také při onemocnění ledvin jsou stanovovány aktivity antioxidačních enzymů, hladiny nízko- a vysokomolekulárních antioxidantů a TAC tělních tekutin. Právě při onemocnění ledvin, kdy je narušena jejich exkreční schopnost a dochází k akumulaci nízkomolekulárních látek, např. kyseliny močové a produktů oxidačních reakcí, je hodnota TAC zkreslena. Proto je vhodné a nutné stanovovat nejenom hladiny TAC, ale i hladiny jednotlivých antioxidantů a ty korelovat s hladinami produktů OS, např. AOPP, a produkty peroxidace lipidů, aby interpretace získaných výsledků byla správná [50].

Závěr

Osoby s chronickým selháním ledvin mají vyšší riziko kardiovaskulárních onemocnění, které je jednou z hlavních příčin jejich úmrtí. Na tomto faktu se kromě celé řady faktorů významně podílí OS. Proto sledování TAC a parametrů OS, správná interpretace zjištěných dat a případná suplementace antioxidanty či zlepšení stravovacích návyků může výrazně přispět k zlepšení zdravotního stavu této skupiny osob.

Práce vznikla v rámci projektů IGA MZ ČR NS 9964/4 a MŠ ČR (MSM 6198959216).

Seznam použitých zkratek

• AOPP – produkty pokročilé oxidace proteinů
• GPX – glutationperoxidáza
• GR – glutationreduktáza
• GSH – redukovaný glutation
• GST – glutationtranferáza
• HDL – lipoprotein o vysoké hustotě
• HO^• – hydroxylový radikál
• KAT – kataláza
• LDL – lipoprotein s nízkou hustotou
• MK – mastná kyselina
• NO^• – oxid dusnatý
• NO₂^• – radikál oxidu dusičitého
• NO₂Cl – chlorid nitrylu
• 8-OH-dG – 8-hydroxy-2’-deoxyguanosin
• ONOO¯ – peroxynitrit
• ONOOH – kyselina peroxynitritová
• OH¯ – hydroxidový anion
• OS – oxidační stres
• ox-LDL – oxidované LDL
• PNMK – polynenasycené mastné kyseliny
• RAGE – receptor pro pokročilé produkty glykace proteinů
• ROS – reaktivní formy kyslíku
• RONS – reaktivní formy kyslíku a dusíku
• RNS – reaktivní formy dusíku
• SOD – superoxiddismutáza
• TAC – celková antioxidační kapacita
• TL – transplantace ledvin
• VR – volné radikály

Ing. Adéla Galandáková, Ph.D.

http://medchemrs.upol.cz

e-mail: galandakova.a@seznam.cz

Doručeno do redakce: 13. 5. 2011

Přijato po recenzi: 10. 10. 2011