Vliv metylace DNA na vznik nádorových onemocnění

Súhrn

Východiska:

Výzkum posledního desetiletí potvrdil význam epigenetických procesů při vzniku, vývoji a léčbě nádorových onemocnění. Především sekvenování nové generace umožnilo zmapovat lidský epigenom a sledovat jeho změny během kancerogeneze. Tento přístup odhalil přímá napojení epigenetických abnormalit na mutace genů, které kontrolují metylaci DNA, sbalování a funkci DNA v chromatinu, nebo na metabolizmus buněk. Epigenetické změny DNA se vyskytují už v časných fázích vývoje nádorových onemocnění, a jsou tedy slibnými kandidáty na diagnostické a prognostické markery a současně epigenetické procesy představují vhodné cíle pro vývoj nových terapeutických látek. Získané poznatky o aberantní metylaci DNA umožňují dva různé pohledy na to, jak daná modifikace přispívá k vývoji nádorového onemocnění. První pohled předpokládá, že normální buňky podléhají transformaci vlivem řídicích mutací, kdy následné metylace de novo a demetylace DNA přispívají k řadě programových změn genové exprese. Alternativní přístup pohlíží na změny v metylaci DNA jako na důsledek např. stárnutí buněk. A právě tyto získané změny zvyšují citlivost DNA ke vzniku mutací a k následné onkogenní transformaci.

Cíle:

Cílem přehledového článku je shrnout dosud známé úlohy abnormální metylace DNA při vývoji nádorového onemocnění a představit již publikovanou alternativní teorii, která k dané problematice přistupuje méně obvyklým způsobem.

Klíčová slova:

metylace DNA – polycomb proteinový komplex – CpG ostrůvky

Úvod

Již během 80. let 20. století byly zaznamenány změny v metylaci DNA nádorových buněk [1] a pozdější intenzivní výzkum přinesl další znalosti o struktuře a modifikacích chromatinu a jejich vlivu na genovou expresi. Ukázalo se, že vznik a progrese nádorového onemocnění jsou podmíněny nejen genetickými, ale i epigenetickými změnami a do odborného jazyka tak vstupuje pojem „nádorový epigenom“. Sekvenování nové generace využívané pro zmapování chromozomů a metylací DNA u normálních, nádorových nebo pluripotentních kmenových buněk přineslo nové poznatky o struktuře chromatinu a postavení nukleotidů a o tom, jak tyto změny přispívají ke vzniku a rozvoji různých onemocnění. Zároveň se tím otevřely možnosti pro nalezení nových nádorových markerů a terapeutických cílů.

Metylace DNA

Za základní epigenetický mechanizmus je považována metylace DNA, tedy kovalentní připojení metylové skupiny k adeninu nebo cytosinu (u adeninu na 6. uhlík, u cytosinu na 4. nebo 5. uhlík) [2]. V savčím genomu se vyskytuje pouze 5-metylcytosin (5mC) v rámci CpG (cytosine-phosphatidyl-guanin) dinukleotidů [3]. Metylace DNA regulují expresi genů bez změny genetické informace a ovlivňují replikaci, rekombinaci a opravy DNA nebo sestřih heterogenní nukleární RNA. Působí tak na vývoj kmenových buněk, diferenciaci a udržování buněk a tkání. Dále se podílejí na zachování genomové stability, potlačují transkripci repetitivních sekvencí a retrovirové DNA, zabraňují translokaci transponovatelných elementů a během zárodečného vývoje kontrolují expresi imprintovaných genů. Změny v epigenetických regulačních mechanizmech probíhají během procesu stárnutí a za patologických podmínek přispívají ke vzniku rakoviny nebo autoimunitních a degenerativních onemocnění [4].

Metylace DNA je zprostředkována DNA metyltransferázami (DNMTs), které využívají jako zdroj metylové skupiny  S-adenosylmethionin. DNMT1 je zodpovědná za udržovací metylace, kdy katalyzuje připojení metylové skupiny k dinukleotidu CpG na hemimetylovaných vláknech DNA během replikace. DNMT3A a DNMT3B zajišťují metylaci de novo [5]. Ztráta metyltransferázy DNMT1, která zajišťuje dědičné metylační vzory DNA, je letální. [6].

Demetylaci DNA řídí translokační proteiny TET (tet methylcytosine dioxygenase), které katalyzují konverzi 5-metylcytosinu na 5-hydroxymetylcytosin a následně na cytosin. Množství hydroxylovaných cytosinů v promotorech genů koreluje s jejich expresní aktivitou, přičemž přítomnost metylcytosinu vede k represi transkripce. Modifikace DNA metylací přímo fyzicky brání transkripčním faktorům nasednout na jejich vazebné místo nebo se díky ní na DNA navážou tzv. proteiny vázající metylované CpG (methyl-CpG binding proteins – MBP), které mění chromatinovou strukturu a regulují tak vazbu dalších faktorů [7].

Metylace DNA u nádorů

U nádorových buněk se často vyskytuje komplexní ztráta metylace soustředěná do hypometylovaných bloků nebo naopak hypermetylace určitých oblastí [8]. Celogenomové sekvenování vzorků normální a nádorové tkáně tlustého střeva prokázalo, že ztráta metylace DNA není náhodná, ale většinou postihuje rozsáhlé oblasti (v řádu megabází) u mnoha chromozomů [9]. Jedná se především o jaderné oblasti spojené s laminem, kde probíhá pozdní replikace. Domény spojené s laminem tvoří asi 40 % genomu a obsahují repetitivní sekvence chudé na geny [10,11]. Předpokládá se, že hypometylace nepromotorových sekvencí DNA a strukturních částí, jako je centromera, zvyšují genomovou nestabilitu [12] a mutace genů pro metyltransferázy, které vedou ke ztrátě metylace DNA, jsou spojovány se strukturními změnami chromozomů [13]. Hypometylace promotorových sekvencí je zodpovědná za nadměrnou expresi protoonkogenů, růstových faktorů a genů zapojených do regulace proliferace, invazivity a metastazování nádorových buněk [14], hypometylace retrotransposonů pak podporuje kancerogenezi destabilizací genomu prostřednictvím inzerčních mutací a rekombinací mezi nealelickými repeticemi [15].

Nejčastěji sledovanou epigenetickou změnou u nádorů je však nyní abnormální metylace DNA de novo u standardně nemetylovaných promotorů a s tím související potlačení transkripce a ztráta genové exprese [16,17].

Hypermetylace CpG ostrůvků

CpG dinukleotidy nejsou v genomu zastoupeny často a většinou se soustřeďují do krátkých oblastí (0,5–4 kb) známých jako CpG ostrůvky. CpG ostrůvky byly během evoluce umístěny a zachovány v oblastech DNA, které mají funkční význam. Regulují chromatinovou strukturu, čímž ovlivňují vazbu transkripčních faktorů a výsledně i genovou expresi. U většiny genů savčího genomu se CpG ostrůvky nacházejí v počátečních oblastech promotorů a prvního exonu a v normálních buňkách obvykle nejsou metylovány. Metylace CpG ostrůvků vede ke stabilnímu snížení exprese těchto genů.

Mapování metylací DNA u nádorových buněk potvrdilo, že téměř všechny typy nádorů obsahují stovky genů s abnormální metylací, přičemž v normálních buňkách není 5–10 % CpG ostrůvků těchto promotorů od embryonálního vývoje nikdy metylováno [3]. Překvapivě jsou hypermetylace promotorů u nádorových buněk minimálně stejně tak časté jako výskyt mutací nádorových supresorů. Aberantní metylace promotoru spojené s jeho umlčením představují selektivní výhodu pro neoplastické buňky podobně jako mutace. Téměř 50 % genů, jejichž zárodečné mutace vedou k dědičným formám rakoviny, podléhá i hypermetylaci a následnému potlačení jejich exprese. Příkladem je gen BRCA1 kódující nádorový supresor, jehož zárodečné mutace jsou spojeny se zvýšeným rizikem vzniku karcinomu prsu (breast cancer – BC). U 10–15 % žen s BC, které nenesly mutaci BRCA1, byla nalezena hypermetylace tohoto genu. Profily genové exprese BC s hypermetylovaným i mutovaným BRCA1 jsou totožné, a je tedy zřejmé, že i důsledky obou typů aberací BRCA1, tj. mutace i hypermetylace, jsou stejné [18,19].

Předpokládá se, že ztráta exprese nádorových supresorů se fenotypově projeví jen v případě, že jsou inaktivovány obě alely genu. Některé studie však ukázaly, že jedna z alel genu může stabilně nést zárodečnou mutaci a druhá je inaktivována právě metylací [20]. Nicméně se zdá, že metylována je vždy jen wild type alela a nikdy ne alela mutovaná [21].

Podobně jako se mutace DNA často objevují u specifických genů (TP53, KRAS apod.), které působí jako spouštěče nádorového bujení, jsou známy i epigenetické změny, které se u nádorů vyskytují poměrně často. Příkladem jsou hypermetylace nádorového supresoru VHL u karcinomu ledvin nebo CDKN2A (kódující nádorové supresory INK4A a ARF) u karcinomu plic [22], jícnu [23], Burkittova lymfomu [24] nebo melanomu [25].

Seznam identifikovaných genů, u kterých dochází u různých typů nádorů ke snížení exprese v důsledku hypermetylace, se neustále rozšiřuje. Tyto geny jsou pravděpodobně důležité pro vývoj daného nádoru z podstaty jejich funkce, ale nepodléhají často mutacím. Příkladem je gen MGMT nezbytný pro genomovou stabilitu, růstový regulátor CDKN2B nebo supresor proliferace RASSF1A [26,27]. Předpokládá se, že hlavním působením metylací je jejich nahromadění do jednotlivých signálních drah, které napomáhají vzniku a vývoji rakoviny [28]. Příkladem jsou geny pro transkripční faktory GATA4 a GATA5, které řídí epiteliální diferenciaci u karcinomu tlustého střeva a které bývají souběžně hypermetylovány spolu se svými cílovými geny [29]. Souběžné hypermetylaci podléhají i geny negativně regulující signální dráhu WNT a doplňují tak vliv řídicích mutací APC a CTNNB1, které WNT dráhu naopak aktivují [30]. Součinnost různých hypermetylovaných genů navíc přispívá i k narušení signální  dráhy p53.

Metylace DNA přispívá ke vzniku mutací DNA

Epigenetické změny často zvyšují riziko vzniku mutací v průběhu vývoje nádoru. Poprvé byl tento jev popsán u genu MLH1, který je často hypermetylován u nádorů s vysokou hladinou nestability mikrosatelitů, jako jsou nádory tlustého střeva a konečníku [31]. Dalším genem, který je nezbytný pro opravy DNA a podléhá hypermetylaci, je MGMT. MGMT kóduje protein O⁶-alkylguanine DNA alkyltransferázu, který opravuje O⁶-metylguanin vznikající při působení karcinogenů zpět na guanin a zabraňuje tak vzniku mutací (tranzicí) G ® A. Nádory s umlčenými alelami genu MGMT jsou pak náchylné k mutacím v klíčových genech, jako je TP53 nebo KRAS [32].

Metylace cytosinu může ovlivnit vznik a vývoj nádoru i jinými mechanizmy, než je umlčení genové exprese. Samotná 5-metylace cytosinu je v podstatě mutagenní, protože může vést ke spontánní deaminaci a následné tranzici C ® T [33]. Uvádí se, že až 50 % inaktivujících bodových mutací nádorového supresoru TP53 u somatických buněk vychází z metylovaného cytosinu [34]. Přítomnost metylové skupiny u CpG v kódující oblasti TP53 zvyšuje výskyt mutací vyvolaných UV zářením u nádorů kůže, protože zvyšuje citlivost cytosinu k oblasti spektra převládajícího u slunečního záření [35]. Metylované CpG jsou i cílem tranzičních mutací C ® T vyvolaných karcinogenem benzo (a) pyren diol epoxid, který je přítomen v tabáku [36]. Skutečnost, že kódující sekvence TP53 obsahuje velké množství metylovaných CpG, tedy může zvyšovat pravděpodobnost vzniku mutací tohoto genu.

Metylace DNA a polycomb proteiny

Metylace DNA je spojována především s potlačením genové exprese a předpokládá se, že její hlavní úlohou při tumorigenezi je inaktivace nádorových supresorů. Ačkoliv byl tento typ inhibice pozorován u nádorových buněčných linií [37], je tento pohled poněkud zjednodušený. Metylace CpG de novo se nevyskytuje pouze u nádorových buněk, ale v nízké hladině byly pozorovány i u normálních tkání a jejich množství se postupně navyšuje s věkem [3,38]. Podobně i demetylace typické pro nádorové buňky se objevují u normálních stárnoucích hematopoetických a epidermálních kmenových buněk  in vivo [39].

Několik studií prokázalo, že většina genů metylovaných u nádorů de novo je transkripčně neaktivní i u normálních buněk, což je v souladu s tvrzením, že většina cílových genů pro metylaci je označena tzv. polycomb komplexem (polycomb-group proteins – PcGs) [40]. PcGs představují rodinu proteinů, které využívají epigenetické mechanizmy k udržení nebo potlačení exprese cílových genů. Původně byly objeveny u Drosophila melanogaster, ale jejich úloha v regulaci vývojových genů byla prokázána u mnoha živočišných druhů. PcGs potlačují transkripci genů nezbytných pro tvorbu vývojových linií z embryonálních nebo dospělých kmenových buněk [41,42]. Exprese těchto genů je během raného embryonálního vývoje potlačena vazbou PcGs, které zprostředkovávají metylaci histonu H3 pomocí histon metyl transferázy (EZH2), a dochází k lokální tvorbě fakultativního heterochromatinu. To je relativně plastická struktura, která může být jednoduše zrušena uvolněním PcGs a dochází k obnově transkripce [43]. Tato regulace bez přítomnosti abnormální metylace DNA promotorů byla pozorována u mnoha typů nádorů. Předpokládá se, že molekulární vývoj během tumorigeneze začíná abnormální expanzí dospělých kmenových buněk a progenitorů, kde u CpG ostrůvků v rámci promotorů dochází k nahrazování flexibilního umlčení genů pomocí PcGs mnohem stabilnější regulací spojenou s metylací DNA, která je zprostředkována de novo metylázami DNMT3A a 3B [44,45]. Je zřejmé, že spíše než potlačení aktivních genů postihuje metylace již umlčené geny a hlavní úlohou je zabránění jejich  reaktivace [46].

Protože většina CpG, které podléhají změnám de novo, je standardně označena PcGs, jsou výsledné metylační vzory u všech tkání podobné, ačkoliv se intenzita metylací liší mezi jednotlivými nádory, např. je vysoká u nádorů střev nebo naopak nízká u nádorů mozku [47]. V principu zde tedy musí existovat další kontrolní mechanizmy, které řídí metylace de novo a pravděpodobně vycházejí z vývojové historie jednotlivých buněčných typů. Například lokální záněty zvyšují pravděpodobnost nádorové transformace a metylace DNA je do těchto procesů také zapojena [48,49]. Podobně působí i oxidační stres, který přímo ovlivňuje vazbu DNA metyltransferáz na cílové geny označené  PcGs [50].

Co bylo dříve, mutace,  nebo metylace?

Podle Klutsteina et al lze na současné znalosti o metylacích DNA u nádorů nahlížet ze dvou stran [51]. Buď mohou 1. normální buňky podlehnout nádorové transformaci v důsledku genetické mutace a následná metylace a demetylace DNA vede k celkové programové změně genové exprese, nebo se 2. subpopulace buněk, u kterých došlo ke změnám v metylaci DNA, např. v důsledku stárnutí, stává náchylnější k onkogenní transformaci [49]. Podle druhého modelu je přítomnost abnormální metylace u nádoru důsledkem výběru primární buňky s charakteristickým metylačním fenotypem, ze které nádor vznikl. Pokud je tento fenotyp jednou ustanoven, přenáší se na dceřiné buňky podobně jako mutace. Velké množství důkazů napovídá, že metylace DNA související s nádory nebo stárnutím pochází z malé populace buněk. Jako příklad uvádí Klutstein et al vývoj nádorů tlustého střeva [51]. Střevní epitel se neustále obnovuje díky kmenovým buňkám umístěným ve střevních kryptách. Kmenové buňky produkují proliferující buňky, které v určitém bodě podléhají diferenciaci a vytvářejí nový střevní epitel. Většina genů podílejících se na tomto kroku je řízena vazbou PcGs. Během vývoje jsou tyto geny vazbou PcGs umlčeny a k jejich reaktivaci dochází až po jejich uvolnění. Následně se začínají produkovat transkripční faktory, které vedou k diferenciaci buněk. Během stárnutí podléhá subpopulace kmenových buněk metylacím de novo na cílových CpG ostrůvcích a vznikají malé oblasti tkáně s aberantním metylačním profilem. Tato modifikace vede k tvorbě konstitutivního heterochromatinu, který nelze jednoduše změnit. Takové kmenové buňky mohou sice odstranit z cílových diferenciačních genů PcGs, ale k reaktivaci jejich transkripce nedochází. Buňky se nepřeměňují na epiteliální a zůstávají v proliferativním stavu. Tím vznikají příznivé podmínky pro maligní transformaci, ať už v důsledku genetické predispozice, nebo spontánní mutace. Tuto teorii podporují zjištění, že cílová místa jsou již částečně metylována u normálních buněk a silně modifikována u raných prekancerózních stadií, tzv. polypů [47]. Během obnovy střevního epitelu z kmenových buněk umístěných v kryptách dochází k rychlým a častým přeměnám. Proto je metylační vzorec u normálních střevních buněk stejný jako u příslušných kmenových buněk. Metylace DNA u buněk jedné střevní krypty se zdají být uniformní, mezi jednotlivými kryptami se však liší. Předpokládá se, že jednotlivé CpG ostrůvky podléhají abnormální metylaci de novo zcela individuálně, některé jsou silně modifikovány, jiné zcela nemetylovány, ale u jiných tkání tomu může být naopak. To naznačuje, že v každé tkáni jsou přítomny buňky s nízkou hladinou metylace de novo a jiné buňky mají metylaci CpG ostrůvků vysokou. A pravděpodobně jsou to právě tyto buňky, které následně podléhají transformaci a získávají selekční výhodu. Podle této teorie metylace de novo existují již u subpopulace normálních buněk ještě před jejich transformací podmíněnou genetickou mutací [51].

Malignity krvetvorby jsou dalším příkladem, jak změny v metylaci DNA přispívají k vývoji nádorů. Myelodysplastický syndrom nebo akutní myeloidní leukemie jsou onemocnění vyznačující se poruchou diferenciace krevních buněk, jejichž riziko stoupá s věkem pacientů. Několik studií popisuje, že během stárnutí jak u myší, tak i u člověka se zvyšuje počet hematopoetických kmenových buněk, jejichž schopnost diferenciace do lymfocytů je snížena a převládá myeloidní fenotyp. Bisulfitové studie celého genomu prokázaly, že tento proces je spojen se specifickými metylacemi de novo a demetylacemi standardně přítomnými u nádorů a je pravděpodobné, že tyto změny přispívající k obnově kmenových buněk a ztrátě diferenciace jsou výsledkem přirozeného stárnutí bez přítomnosti genové mutace.

Závěr

V uplynulých letech došlo ke značnému pokroku v problematice nádorové epigenetiky. Velká část výzkumu byla věnována charakteristice epigenomu normálních a nádorových buněk s cílem definovat přesný buněčný původ nádoru a využití epigenetiky ke zlepšení klasifikace jednotlivých podskupin nádorů. Nyní se pozornost obrací k objasnění funkcí jednotlivých epigenetických modifikací. V poslední době se pojmy genetika a epigenetika k sobě přibližují a ustupuje boj o to, která ze změn DNA je pro iniciaci a progresi nádorů důležitější. Naopak je zřejmé, že mutace a epigenetické změny DNA vzájemně „spolupracují“ na vzniku a vývoji tohoto onemocnění. Otevírají se další možnosti pro hledání biomarkerů a nových preventivních a terapeutických strategií. Cílem příštích let tedy bude zavedení DNA metylačních markerů do klinické diagnostiky a využití identifikovaných epigenetických terapeutických cílů pro léčbu nejen nádorových  onemocnění.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413.

Autorka deklaruje, že v souvislosti s předmětem studie nemá žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Jitka Holčáková, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7 656 53 Brno

holcakova@mou.cz

Přijato: 27. 8. 2018