Dysplastické změny megakaryopoézy podle WHO klasifikace 2008

Súhrn

Dysplazie v megakaryocytech je častým nálezem nejen u nemocných s diagnózou myelodysplastického syndromu, ale taktéž v širokém spektru jiných klinických situací. V tomto článku autoři shrnuli možnosti a také limitace vyšetření nátěrů periferní krve a kostní dřeně v průběhu diagnostiky myelodysplastického syndromu. V úvodu je rovněž zmíněna normální megakaryopéza z morfologického pohledu.

Klíčová slova:
megakaryopoéza –  dysplastické změny –  myelodyplastický syndrom

Megakaryopoéza a trombopoéza

Krevní destičky jsou důležitými elementy periferní krve, které se kromě účasti na krevním srážení podílí i na řadě dalších procesů probíhajících v lidském organizmu, jako jsou např. zánět, přirozená imunita, neoangiogeneze a metastazování nádoru [1]. Vznikají v procesu nazývaném megakaryopoéza. Ten začíná v hemopoetických multipotentních kmenových buňkách. Následně dochází k vývoji cestou multipotentního progenitoru, který již má omezenou schopnost sebeobnovy, dále pak myeloidního progenitoru schopného vyzrávat do všech myeloidních linií a dále pak společného progenitoru pro erytroidní- megakaryocytovou řadu. Někteří věří, že tento typ buňky může vznikat i přímo z hemopoetické kmenové buňky [2]. Megakaryocytární progenitor dává vznik koloniím megakaryocytů v tkáňových kulturách. Je charakterizován imunofenotypizačním nálezem CD34, CD31 a CD133. Podle exprese HLA-DR lze odlišit méně zralý progenitor, tj. BFU- MK, který má expresi tohoto znaku nízkou, a dále více zralý, tj. CFU- MK, který má expresi HLA-HR vysokou. První buňkou, která může být za jistých okolností rozeznána cytologicky, je megakaryoblast [3]. Běžně je těchto elementů přítomno okolo 3 % z CD34 pozitivních buněk [1] a v případě normální krvetvorby je od jiných blastů nerozeznáme, neboť jde o malou diploidní buňku s proliferačním potenciálem [3]. Do tohoto stadia prekurzory megakaryocytů podléhají normálním procesům proliferace, které zahrnuje zdvojení obsahu DNA a následné rozdělení buňky na dvě dceřiné. Poté, co je zahájena syntéza destičkových proteinů, nastupuje proces zvaný endomitóza. Již dlouho je známo, že na rozdíl od jiných buněčných linií, u nichž je amplifikace provázená duplikací DNA s následným rozdělením buňky, megakarocyty násobí obsah DNA bez buněčného dělení. Amplifikace tak vede k polypoidizaci buňky, a tím i k jejímu zvětšování, nicméně procesy maturace charakterizované vývojem specifických organel jsou zahájeny až poté, co je amplifikace ukončena [4]. Endomitóza spočívá v odchylném procesu buněčného cyklu, kdy proběhne normální fáze G1, S i G2, resp. i začátek mitózy, tj. profáze a metafáze a nakonec i první část anafáze (tzv. anafáze A), která je charakterizovaná separací sesterských chromatid a pohybem chromozomů k pólům [5]. Následná část anafáze (tzv. anafáze B) probíhá odchylně –  nenásleduje po ní normální rozdělení jaderného chromatinu do dvou separátních jader a následně i rozdělení buňky, tzv. cytokineze. Potenciální dceřiné buňky se naopak pohybují k sobě, splývá jaderný chromatin i celá buňka. Na konci endomitózy vzniká megakaryocyt s jedním jádrem a jednou jadernou membránou. Navíc u polyploidních megakaryocytů je dělicí vřeténko taktéž multipolární, přičemž počet těchto pólů koresponduje s úrovní „ploidity“ [1]. Duplikace DNA může být v megakaryocytu ukončena kdykoli mezi 2N (tedy normální diploidní buňka) a 64N, možná i 128N. Většina lidských megakaryocytů (okolo 50 %) má 16N, tedy jádro osmkrát větší než normální diploidní buňka. V průběhu tohoto procesu se navyšuje syntéza proteinů důležitých pro funkci destiček a současně dochází ke zvětšování objemu buňky na hodnotu více než 80násobnou. Současně s narůstáním ploidity dochází k navýšení rozměru buňky –  u buněk 2N mají megakaryocyty rozměr 21 ± 4 µm, zatímco u buněk s 64N 56 ± 8 µm, a tím se zvyšují i schopnosti megakaryocytů produkovat trombocyty [6]. Každý lalok jádra odpovídá příslušné oblasti multipolárního dělicího vřeténka a jejich počet odráží stupeň ploidity [5]. Není úplně vyjasněno, jaký význam má vývoj polyploidního jádra v megakaryocytech. Zdá se, že je to cesta ke zvyšování syntézy proteinů a modifikování genové exprese spojené s vyzráváním a polyploidizace je zřejmě integrována do diferenciačního programu megakaryocytů [1]. Stupeň ploidity je v přímé korelaci s obsahem DNA a se stupněm produkce destiček [6]. Spolu s endomitotickým procesem se začíná měnit i cytoplazma, stává se objemnější, navyšuje se počet granulí a dochází k produkci membránových systémů. Zralý megakaryocyt se přesunuje do blízkosti venózních sinusů kostní dřeně. Ve výběžcích jeho cytoplazmy vznikají „protodestičky“, ty se větví a prodlužují a zasahují do vlastního sinusu [7]. Velké protodestičky se pak oddělují od mateřského megakaryocytu a vlastní destičky z nich vznikají až v cirkulaci [1]. Celý proces megakaryopoézy trvá asi 8– 10 dní [8].

Proliferace megakaryocytů a tvorba trombocytů je primárně regulována interakcí mezi trombopoetinem (TPO) a jeho povrchovým buněčným receptorem (MPL). Proces megakaryopoézy je však ovlivňován i řadou transkripčních faktorů, z nichž jedním z nejdůležitějších jsou zejména GATA1- protein, případně FOG- 1 (friend of GATA- 1). Ty jsou postiženy u X- vázané kongenitální trombocytopenie [9]. GATA- 1 může spolupracovat i s AML-1 (RUNX1), resp. transkripčním komplexem „core binding factor“ (CBF), tedy s faktory, jejichž geny jsou často zasaženy v případech akutní myeloidní leukemie. Na myších modelech vede jejich chybění k dysmegakaryopoéze. Podobně u další vrozené trombocytopenie, tzv. Paris-Trousseauova/Jacobsenova syndromu, je přítomna delece chromozomu 11q23 zahrnující chybění transkripčního faktoru FLI- 1, který spolupracuje s GATA1 a FOG- 1 na expresi genů pro destičkové glykoproteiny. To je jen několik příkladů z mnoha, které by mohly být uvedeny. Mají ilustrovat, jak zásah do těchto regulačních proteinů může vést k vrozené, ale taktéž získané poruše normální megakaryopoézy.

Morfologické nálezy v průběhu normální megakaryopoézy

Z morfologického hlediska rozeznáváme tři stadia zralosti megakaryocytů [3]. Megakaryocyty skupiny I mají silně bazofilní cytoplazmu, vysoký nukleo- cytoplazmatický (N/ C) poměr (obr. 1). Skupina II zahrnuje megakaryocyty s nižším N/ C poměrem, cytoplazma je méně bazofilní a obsahuje azurofilní granula (obr. 2). Megakaryocyty III. skupiny mají objemnou slabě bazofilní cytoplazmu a bohatou azurofilní granulaci. Při okrajích je však cytoplazma agranulární (obr. 3). Tyto poslední megakaryocyty již nesyntetizují DNA, jejich jádra nepodléhají endomitóze, ale jsou schopny produkovat destičky. Ve všech třech skupinách megakaryocytů jsou elementy s jádry 8N (tj. s obsahem chromatinu čtyřnásobným ve srovnání s běžnou diploidní buňkou), 16N a 32N. 4N megakaryocyty jsou obvyklé jen ve skupině I, zatímco 32N megakaryocyty jsou nejčastější ve skupině III. Jádra převážné většiny normálních polyploidních megakaryocytů tvoří nepravidelné laloky spojené chromatinovými vlákny. Poté, co se cestou tvorby protodestiček zasahujících do sinusů kostní dřeně s následnou cytoplazmatickou fragmentací vytvoří krevní destičky, dostávají se megakaryocyty do finálního stadia, kterým je zdánlivě holé jádro, které má ve skutečnosti tenký prstenec cytoplazmy. Velikost megakaryocytů je udávána v širokém rozmezí 30– 160 µm podle stadia jejich zralosti [3].

V cytologickém morfologickém nálezu je důležité zhodnocení počtu megakaryocytů. Nicméně toto stanovení je obvykle velmi subjektivní a umožňuje jen říci, zda je megakaryopoéza normální, snížená, či zvýšená [3]. Jindy je udáván počet 2– 20 megakaryocytů na 1 000 jaderných buněk dřeně [8]. Přesnější určení počtu megakaryocytů umožňuje vyšetření histologické. I zde je však rozdíl, zda je vyšetřeno koagulum z aspirační biopsie či vzorek získaný odběrem kostní dřeně trepanobiopsií. Obvykle je zjišťováno méně megakaryocytů z prvního materiálu, zřejmě proto, že není tak jednoduché velké megakaryocyty aspirovat [3].

I v normální kostní dřeni lze zachytit proces nazývaný emperipoléza (obr. 3). Jde o zdánlivé pohlcení jiných hematopoetických buněk megakaryocytem. Tento proces se liší od fagocytózy, neboť buňky vstupují do megakaryocytu a cestují v něm dilatovanými dutinami demarkačního membránového systému.

Myelodysplastický syndrom ve WHO klasifikacích

Jako myelodysplastický syndrom (MDS)označujeme skupinu klonálních chorob hemopoetické kmenové buňky. Tato skupina je charakterizována cytopenií či cytopeniemi, dysplazií jedné či více krvetvorných řad, inefektivní hematopoézou a vyšším rizikem vývoje akutní myeloidní leukemie [10]. Vzhledem k tomu, že jde o více typů onemocnění s různou prognózou, byla vždy vyvíjena snaha o nastavení přesných kritérií pro odlišení jednotlivých stavů. Jako první byla řadu let používána klasifikace francouzských, amerických a britských expertů, tj. FAB klasifikace [11]. Od poloviny 90. let minulého století pracovala řada odborníků na WHO klasifikaci nádorů hemopoetických a lymfatických tkání, přičemž tato byla ve finální podobě vydána v roce 2001 a zahrnovala i podmínky diagnostiky a klasifikace MDS [12]. Vzhledem k rozvoji nových metod laboratorní diagnostiky hematologických malignit a současně vzhledem k nárůstu klinických zkušeností s WHO klasifikací z roku 2001 je vyvíjena snaha mezinárodních pracovních skupin pro jednotlivé skupiny diagnóz o průběžné revidování poznatků a jejich praktické uplatnění [13,14]. Tato skutečnost měla za následek vydání nové WHO klasifikace na podzim roku 2008 a zde byla nově revidována i problematika MDS [10]. Nicméně snahy o rychlé a průběžné zapojování nových informací na poli diagnostiky MDS neutuchají ani po vydání revidované klasifikace [15,16].

Diagnóza MDS je postavena na klinickém vyšetření, vyhodnocení nálezu krevního obrazu, diferenciálního rozpočtu jaderných buněk periferní krve a kostní dřeně včetně případného cytochemického barvení, vyhodnocení nálezu histologického vyšetření kostní dřeně vzorku získaného trepanobiopsií, event. včetně imunohistochemie, posouzení nálezů z průtokové cytometrie, a to jak u vzorků periferní krve, tak i kostní dřeně, zhodnocení nálezů cytogenetického vyšetření včetně jejich modalit (jako je fluorescenční in situ hybridizace). V diferenciální diagnostice zejména vůči akutním myeloidním leukemiím s nízkým počtem blastů lze s výhodou využít i nálezů molekulární genetiky [3]. Nicméně ani zde práce lékaře, který provádí diagnostiku MDS, zdaleka nekončí. Zejména při výskytu podezření na MDS v dětském věku je zapotřebí vyloučit velkou skupinu vrozených chorob dřeňového selhání, zatímco v pozdějším věku je nutno pomýšlet na řadu klinických situací, které mohou normální krvetvorbu ovlivnit, a to včetně morfologického cytologického nálezu v kostní dřeni. Přehled podává tab. 1.

Nezbytnou podmínkou cytomorfologické diagnostiky MDS je provedení dokonalého nátěru jak z periferní krve, tak z aspirační biopsie kostní dřeně. Tento musí být náležitě nabarven základním barvením (v našich podmínkách nejčastěji dle May- Grünwald- Giemsa, v zahraničí také Wright- Giemsa), resp. pro nátěry zejména z kostní dřeně je běžně využíváno i barvení cytochemické [17]. Rutinně je v případě diagnózy MDS prováděno na obsah železa Perlsovo barvení, které umožní hodnotit zásoby železa, počet sideroblastů, abnormální a zejména prstenčité sideroblasty. Bez tohoto stanovení se klasifikace MDS neobejde. Stejně tak je naprosto nezbytné provést cytochemické barvení na přítomnost myeloperoxidázy v neutrofilních granulocytech. To může odhalit jednak přítomnost Auerových tyčí, jejich nález posouvá kategorizaci MDS do vyššího stadia (tab. 2), jednak snížení myeloperoxidázy ve zralejších stadiích granulopoézy je samostatnou známkou poruchy normálního vývoje těchto buněk. Barvení na obsah glykogenu metodou „Periodic Acid Schiff“ (PAS) může být pozitivní v normoblastech, což je hodnoceno jako nezávislá známka dysplastické erytropoézy, navíc ale může být nápomocno k rozpoznání abnormních megakaryocytů [18].

V základním barvení je proveden rozpočet nejméně na 200 jaderných elementů periferní krve a na 500 jaderných elementů kostní dřeně [10,12]. Normoblasty v periferní krvi a megakaryocyty v periferní krvi i kostní dřeni se do tohoto rozpočtu nezahrnují [17]. Je-li erytropoéza významně zmnožena, pak by měl rozpočet zahrnovat nejméně 100 non-erytroidních elementů. Tento rozpočet slouží zejména ke stanovení počtu myeloblastů, a tím i k přesné kategorizaci typu MDS (tab. 2).

WHO klasifikace navíc stanovuje pro morfologickou diagnózu myelo-dysplazie, že pro určení dysplastických změn pro potřeby diagnózy MDS musí být přesně určenými morfologickými odchylkami postiženo nejméně 10 % buněk každé vývojové řady [10,12]. Přehled těchto odchylek v jednotlivých buněčných liniích shrnuje tab. 3 [3,10,19]. WHO klasifikace 2008 upřesňuje, že procento zastoupených dysplastických změn musí být určeno na 200 buňkách granulopoézy, 200 buňkách erytropoézy a nejméně 30 megakaryocytech [10].

Známky dysplazie v megakaryocytární řadě

Z tohoto pohledu je jedním z nejdůležitějších nálezů průkaz velmi malých forem megakaryocytů, tzv. „mikromegakaryocyty“ (obr. 4). Není arbitrárně stanoveno, jak „malý“ má být mikromegakaryocyt. Diskutuje se o rozměrech menších než 15– 30 µm. Praktické se zdá doporučení Bainové z roku 2010, že jde o buňku přibližně velikosti myeloblastu s jedním či dvěma malými kulatými jádry [18]. Tyto buňky nebyly nikdy nalezeny v nátěrech z aspirační biopsie zdravých jedinců. Již o něco méně významný je průkaz nesegmentovaných jader zralých megakaryocytů, případně i multinuklearita, tj. nález více než jednoho zcela separovaného jádra v jednom megakaryocytu (obr. 5). Tyto formy mohou být event. v normální dřeni v nízkém procentu zastiženy [3] a je důležité v těchto případech provést skórování, zda nález morfologických abnormit překročí hranici 10 % [10,12]. Nález megakaryocytů s nelobulizovanými jádry je typický pro MDS spojený s izolovanou delecí krátkého raménka chromozomu 5 [20] (obr. 6), relativně často je v tomto případě i hypoplazie erytropoézy. Nicméně výlučně podle morfologického vzhledu megakaryocytů nelze s jistotou stanovit ani přesnou kategorii MDS ani jasné podezření na tu či onu cytogenitickou abnormitu. Ostatní odchylky považované za dysplastické změny jsou v tab. 3 (obr. 7).

V této souvislosti je nutno zmínit skutečnost, že megakaryocyty jsou nejčastěji postiženy v případech neklonální myelodysplazie navozené širokou paletou získaných klinických stavů (tab. 1), zatímco změny v erytropoéze a granulocytech nastávají zřetelně méně často. Z tohoto pohledu je zapotřebí hodnotit morfologické odchylky v megakaryocytech mnohem více obezřetně, než tomu je v jiných hemopetických řadách. Budeme-li respektovat tento přístup, pak je jasné, že diagnóza refrakterní cytopenie charakteru refrakterní trombocytopenie v rámci MDS typu refrakterní cytopenie s unilineární dyplázií (RCUD), resp. její diferenciální diagnóza vůči jiným, zejména periferním trombocytopeniím, je na základě morfologické diagnostiky nejméně nelehká a v řadě případů až nemožná [21]. Nález dysplastických změn v jiné hematopoetické linii než jen v megakaryocytech činí diagnózu MDS vždy více pravděpodobnou, a to bez ohledu na povinnost komplexního klinického a laboratorního vyšetření u všech nemocných s podezřením na MDS.

Závěr

I když jsou morfologické abnormity megakryocytů častou známkou MDS a mohou v mnoha případech být prvním signálem ke správnému stanovení této diagnózy, není v tomto ohledu postavení cytologické morfologické diagnostiky nikterak výlučné. I dle současných doporučení je nezbytné využít komplexní klinický a laboratorní pohled na potvrzení diagnózy MDS u suspektních nemocných a morfologické nálezy v periferní krvi či kostní dřeni chápat jako jeden z dílů mozaiky takovéhoto multidisciplinárního přístupu [3,10].

MUDr. Alena Buliková, Ph.D.

www.fnbrno.cz

e-mail: abulik@fnbrno.cz

Doručeno do redakce: 24. 3. 2010