DNA analýza AZF oblasti Y chromozómu u Slovákov s poruchou plodnosti

Souhrn

Cieľ štúdie:
Zavedenie metódy DNA analýzy AZF (Azoospermia factor region) oblasti Y chromozómu u mužov s poruchami plodnosti v Slovenskej republike.

Typ štúdie:
Genetická-prospektívna štúdia.

Názov a sídlo pracoviska:
Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LFUK a FNsP, Bratislava.

Metodika:
Detekcia bola robená pomocou polymerázovej reťazovej reakcie, použitím troch rôznych sád sY sekvencií. Na overenie niektorých typov delécií bol použitý fluorescenčne značený diagnostický set.

Výsledky:
Súbor tvorilo 822 mužov, z nich 349 s azoospermiou a 473 s oligospermiou. Delécie v AZF oblasti Y chromozómu boli potvrdené v 38 prípadoch (4,62 %). Z nich je 24 (6,88 %) pacientov zo súboru s azoospermiou a 14 zo súboru pacientov s oligospermiou (2,95 %). Zaznamenali sme delécie v každej z podoblastí AZF (a, b, c), kombinovanú AZFbc deléciu, ale aj deléciu celej AZF oblasti.

Záver:
Štúdia potvrdila, že detekcia mikrodelécii AZF oblasti má diagnostický a prognostický význam a poukázala na dôležitosť selekčných kritérií výberu pacientov.

Kľúčové slová:
mužská neplodnosť, Y chromozóm, mikrodelécie.

ÚVOD

V súčasnosti sa venuje pozornosť genetickým príčinám mužskej neplodnosti, pričom sa analyzujú a identifikujú gény, o ktorých sa predpokladá, že v tomto procese zohrávajú dôležitú funkciu. Pozornosť je zameraná jednak na gény Y chromozómu, ale aj na iné skupiny autozomálnych génov, resp. génov uložených na X chromozóme, ktoré sú esenciálne v determinácii mužského pohlavia, v rámci priebehu a kontroly mužskej spermatogenézy [4].

Ľudský Y chromozóm je jeden z najmenších chromozómov. Obsahuje 57 miliónov bp, nízky počet funkčných génov a má vysoký počet repetitívnych elementov [13]. Na jeho dlhom ramene (Yq11) sa nachádza Azoospermia Factor Region (AZF). Gény a génové rodiny, ktoré patria do tejto oblasti, sú zodpovedné za bezchybný priebeh spermatogenézy [1, 3].

Porovnaním delécií na Y chromozóme u samcov myší a ľudí bol identifikovaný interval niekoľkých génov kontrolujúcich diferenciáciu mužských germinálnych buniek. Tento interval bol mapovaný, klonovaný a funkcia génov z tohto intervalu detailne študovaná [2, 8, 13]. Expresia génov uvedenej oblasti je testes špecifická. Delécie euchromatínovej časti AZF súvisia s azoospermiou alebo ťažkou oligospermiou. Predpokladá sa, že tieto delécie porušujú Y chromozómové gény zodpovedné za spermatogenézu [16]. Delécie, či už kompletnej oblasti, alebo jej jednotlivých častí predstavujú len časť prestavieb v oblasti Yq11. V súčasnosti bolo odhalených niekoľko typov duplikácií, inverzií aj mimo AZF delečného intervalu, ktoré sú výsledkom intra-chromozomálnych nealelických rekombinácií repetitívnych sekvenčných blokov, ktoré sú súčasťou tejto oblasti. Konečný počet génov v spomínaných podoblastiach AZF lokusu bol zistený až po definovaní kompletnej sekvencie oblasti Yq11 v roku 2003. Zistilo sa, že v AZF oblasti sa nachádza 31 Y špecifických génov, ktoré sú exprimované v ľudských semenníkoch a nachádzajú sa v niektorej z bližšie opísaných podoblastiach. 14 génov je proteín kódujúcich a 17 predstavuje proteín nekódujúce transkripty [13, 16].

SÚBOR PACIENTOV A METODIKA

Do laboratória bolo od roku 1998 do roku 2008 zaslaných 822 pacientov s rôznymi formami mužskej neplodnosti. Všetci pacienti boli s typom vyšetrenia oboznámení vopred a vyšetrenie potvrdili informovaným súhlasom. Genetickú ambulanciu navštívili po predchádzajúcom vyšetrení v niektorej z odborných gynekologických alebo urologických ambulancií na Slovensku. Vyšetrenia sa zúčastnili pacienti s azoospermiou a rôznymi formami oligospermie. Semenná analýza bola stanovená podľa protokolu Svetovej zdravotníckej organizácie. Naša spolupráca bezprostredne nadväzovala na ambulancie klinickej genetiky.

Vvyšetrovaných pacientov v počte 822 (priemerný vek 31,7 roka) sme rozdelili do dvoch súborov: pacientov s azospermiou (349) a pacientov s oligospermiou (473). Do druhej skupiny sme zaradili aj pacientov s málopočetnými diagnózami ako, zoospermia, oligoastenospermia a nekrospermia. Kontrolný súbor tvorilo 100 mužov, u ktorých bol počet spermií v ejakuláte vyšší ako 20 miliónov na mililiter a 100 žien ako negatívna kontrola. Všetci pacienti ako aj kontroly mali kaukazský pôvod a pochádzali z rôznych regiónov Slovenska.

Molekulárna analýza

Na detekciu vybraných druhov sekvencií sme použili metódu polymerázovej reťazovej reakcie upravenej podľa „home made“ metódy. Prvotný výber sekvencií sme robili pomocou údajov dostupných v literatúre. Zamerali sme sa na selekčný výber sekvencií tak, aby sme pomocou nich zaznamenali čo najväčší záchyt delécií a pokúsili sa zostaviť sadu sekvencií vhodných na detekciu delécií v AZF (Azoospermia factor region) oblasti u slovenských pacientov. Vzhľadom na uvedenú skutočnosť ako aj na stúpajúce množstvo údajov v literatúre o jednotlivých génoch v príslušných podoblastiach sme zastúpenie vyšetrovaných sekvencií v nami navrhovaných skupinách menili trikrát. Reakcie sme robili buď v duplexoch po dvoch fragmentoch alebo multiplexoch, s viacerými fragmentami. Každý duplex resp. multiplex vrátane kontrol obsahoval kontrolné fragmenty SRY a ZFY. Pre overenie výsledkov sme pri zaznamenaní pozitívnej delécie uvedenú reakciu zopakovali trikrát a príslušnú DNA sme izolovali z druhej vzorky periférnej krvi. Ak bola delécia dokázaná pomocou multiplex reakcie, overenie deletovaných fragmentov vždy prebiehalo v samostatnej PCR. Ako pozitívnu kontrolu sme použili DNA zdravého muža a ako negatívnu kontrolu DNA zdravej ženy, zároveň súčasťou každej reakcie bola slepá vzorka na vylúčenie akejkoľvek kontaminácie.

V našom súbore sme analyzovali zistený záchyt deletovaných sekvencií vzhľadom na súbory s uvedenými diagnózami, a zaujímalo nás percentuálne zastúpenie delécií v jednotlivých podoblastiach AZFa, AZFb, AZFc, ako aj delécie jednotlivých sekvencií. Diagnostickú metódu sme sa snažili vyštandardizovať tak, aby bola dostupná pre väčšinu diagnostických laboratórií na Slovensku. Na základe získaných výsledkov sme sa pokúsili navrhnúť výber takých sekvencií, pomocou ktorých by bolo možné zaznamenať čo najrelevantnejší záchyt delécii AZF oblasti v skupine slovenských pacientov a zároveň zodpovedali smernici European Academy of Andrology (EAA) a European Molecular Genetics Quality Network (EMQN). Ako doplňujúcu metódu sme navrhli využiť inú formu multiplex PCR s použitím detekčného setu Devyser AZF a následnú detekciu na genetickom analyzátore.

V AZF oblasti boli definované 3 AZF podoblasti, ktoré sa označujú AZFa, AZFb, AZFc. Z každej podoblasti sme vybrali sekvencie, ktoré sme použili na zistenie mikrodelécií tejto oblasti. Z AZFa podoblasti to boli sekvencie sY 85, sY 84, sY 86, z AZFb podoblasti sY 129, sY 164, sY 139, sY 143, sY 127, sY 134 a z AZFc podoblasti sekvencie sY 147, sY 158, sY 243, sY 273, sY 220, sY 277, sY 283, sY 254, sY 255, spolu 18 sekvencií.

Nami zostavené sady tvorili nasledovné sekvencie: prvá sada (I) - sY 129, sY 143, sY 147, sY 158, sY 164, sY 243,sY 254, sY 255, sY 273, sY 277, sY 283; druhá sada (II)- sY 85, sY 129, sY 139, sY 143, sY 220, sY 277, sY 283, sY 254, sY 255 a sY 158. Tretiu (III) nami používanú sadu tvorili sekvencie doporučené európskou smernicou EAA, EMQN: sY 84, sY 86, sY 127, sY 134, sY 254, sY 255. Sekvencie sY164 a sY 243 boli z vyšetrení vylúčené bezprostredne po zistení, že patria medzi repetitívne.

V detekčnom sete Devyser AZF sú zastúpené sekvencie sY 255, sY131, sY90, sY81, sY625, sY127,sY157, sY134, sY86,sY84, sY254, sY259, ZFY/ZFX, sY14 (SRY).

Použité metódy

Klinickým materiálom zasielaným na vyšetrenie bola periférna krv, z ktorej sme izolovali DNA buď použitím vysoľovacej „home made“ metódy alebo využitím izolačného kitu Flexigene (Qiagene, Nemecko).

Zloženie reakčnej zmesi

PCR reakcia prebiehala v celkovom objeme 20 μl. Reakčná zmes obsahovala 200 ng genómovej DNA, 1,5 mmol/L MgCl₂, 200 μmol/L dNTP, 0,1–0,5 μmol/L každého primeru, 0,3 U Taq polymerázy s príslušným pufrom (Finnzymes, Fínsko).

Podmienky PCR boli boli nasledovné: 94 °C 5min, (94 °C 1 min, 61 °C 1min, 72 °C 1min)30x, 72 °C 5min. Sekvenci sY 86 mala teplotu annealingu upravenú na 65 °C. PCR amplifikácia sa uskutočnila na termálnom cykléri (MJ Research, USA).

PCR produkty sme elektroforeticky separovali v 2-3% agarózovom géli (Metaphor, Sigma-Aldrich, USA) pri laboratórnej teplote, v TBE tlmivom roztoku pri 200 mA po dobu 2 hodiny. DNA sme vizualizovali pomocou EtBr, ktorý sme pridali priamo do gélu (0,5 μg/μl) s následným presvietením na UV transluminátore. Ako štandard molekulovej hmotnosti DNA sme použili komerčne dodávaný syntetický 100 bp marker (Fermentas, Nemecko).

Pri overení niektorých typov delécií sme použili florescenčný set Devyser AZF (Švédsko), kde sme delécie dokazovali použitím genetického analyzátora ABI 3130 (USA).

VÝSLEDKY

Diagnózy zaslaných pacientov sme rozdelili do 2 skupín: azoospermia a oligospermia.

Celkovo sme delécie v AZF oblasti Y chromozómu potvrdili v 38 prípadoch, čo predstavuje 4,62 %; 24 pacientov s deléciou je zo súboru s azoospermiou, čo predstavuje 6,88 % z celkového počtu pacientov s touto diagnózou a 14 pacientov je zo súboru s oligospermiou, čo predstavuje 2,95 % z celkového počtu pacientov s touto diagnózou.

Najväčší záchyt delécii sme zaznamenali použitím prvej sady sekvencií - 18 pacientov, čo predstavuje 8,7 % z celkového počtu 822 pacientov. Použitím druhej a tretej sady sekvencií sme získali takmer identický záchyt, 3,2 % použitím druhej sady a 3,3 % použitím tretej sady. Súbor sme ďalej podrobne analyzovali a zaujímal nás záchyt delécii v jednotlivých podsúboroch pacientov s azoospermiou a oligospermiou v korelácii s použitou sadou sekvencií. Najvyšší záchyt delécií sme preukázali v skupine oligospermikov (5,3 %) použitím sady I. V skupine pacientov s diagnózou azoospermia sme použitím sady I a III získali rovnaký záchyt 3,3 %. Veľmi nízky záchyt bol v skupine oligospermikov pri použití sady II a použitím sady III sme v skupine oligospermikov nedokázali žiadnu deléciu. Zistené výsledky sú uvedené v tabuľkách 1 a 2. Svoju pozornosť sme taktiež zamerali na zastúpenie jednotlivých delécii v konkrétnych podoblastiach. Výsledky sú uvedené v tabuľkách 3, 4 a 5.

Z uvedených výsledkov vyplýva, že najvyšší počet dokázaných delécii sme zistili použitím sady I. V jednotlivých skupinách diagnóz sme zistili najvyššie zastúpenie delécií v skupine oligospermikov, a to použitím sady I. Najviac delécii pokrývalo AZFc podoblasť a najčastejšie deletovanou sekvenciou bola sekvencia sY 283, ktorá zodpovedá DAZ génu v AZFc podoblasti.

Na zisťovanie delécií v AZF oblasti u slovenských pacientov sme navrhli skupinu sekvencií, ktorá obsahuje sekvencie odporúčané európskou smernicou a je doplnená o sekvencie, ktoré boli v našej skupine pacientov najčastejšie deletované. Nami doporučená sada sekvencií na diagnostiku delécií v AZF oblasti obsahuje nasledovné sekvencie: sY 84, sY86 , sY129, 134, sY 143, sY 147, sY 158, sY220, sY 254, sY 255, sY 277, sY 283.

Zaznamenané delécie v AZFc podoblasti v skupine azoospermikov, ako aj oligospermikov sme dodatočne overili aj použitím setu Devyser AZF. Všetky nami zaznamenané delécie, ktoré sú zahrnuté v sete Devyser, boli opätovne potvrdené aj analýzou týmto setom. Príklady potvrdených delécií setom Devyser dokumentujú obr. 1, 2.

DISKUSIA

Delécie euchromatínovej časti dlhého ramena Y chromozómu oblasti AZF sú zodpovedné za poruchy spermatogenézy. Predpokladá sa, že tieto delécie poškodzujú priamo gény zodpovedné za správny priebeh spermatogenézy. V poslednej dekáde mnoho výskumných a klinických pracovísk opísalo záchyt mikrodelécií u neplodných mužov a molekulárna diagnostika tohto typu poškodení Y chromozómu sa stala dôležitým diagnostickým testom v rámci svetových laboratórií zaoberajúcich sa touto tematikou [4, 5, 7, 9]. Dnes je už známe, že kompletné, ako aj čiastočné delécie nie sú jediným typom prestavieb v rámci AZF oblasti. Boli zaznamenané inverzie, duplikácie, ktoré sú spolu s deléciami výsledkom intrachromozomálnej nealelickej homologickej rekombinácie repetitívnych blokov (NAHR), nachádzajúcich sa v tejto oblasti. Otázkou je, či je možné zostaviť určite haploskupiny v rámci rôznych populácií mužov s poruchami spermatogenézy, ktoré by boli určitou mierou zodpovedné za rozdielne typy a frekvencie delécií medzi jednotlivými haploskupinami. Vzhľadom na skutočnosť, že jednotlivé gény v uvedenej oblasti kódujú proteíny s rôznou funkciou v rámci rôznych štádií spermatogenézy, predpokladá sa, že aj konkrétne typy deléciií budú korelovať s rôznym klinickým obrazom [15]. Napriek stanoveným kritériám o výbere sekvencií na dôkaz delécií v AZF oblasti sa ešte stále stretávame v literatúre s rôznymi hodnotami frekvencií pri záchyte delécií, a nie jednoznačnou genotypovo-fenotypovou koreláciou. Uvedenej skutočnosti zodpovedajú aj naše výsledky, kde v súbore 822 mužov s azoospermiou a oligospermiou sme delécie zaznamenali v 38 prípadoch, čo predstavuje 4,62 % z celkového počtu pacientov. V súbore azoospermikov to bolo u 24 pacientov (6,88 % z celkového počtu pacientov z azospermiou), v súbore oligospermikov v 14 prípadoch (2,95 % z celkového počtu pacientov s oligospermiou).

Pôvodné literárne zdroje uvádzajú, že 10-15 % pacientov s azoospermiou a 5-10 % pacientov s oligospermiou má mikrodelécie v AZF oblasti [2, 8, 10]. Vogt a kol. analyzovali 370 pacientov s idiopatickou azoospermiou a oligospermiou a v 12 prípadoch odhalili de-novo mikrodelécie (3,24 %) [15]. U mužov s azoospermiou je všeobecne zistená vyššia incidencia mikrodelécii ako u mužov s rôznymi formami oligospermie. Nájdená frekvencia však môže v závislosti od zloženia populačnej štúdie varírovať od 2-10 %. Naša hodnota 4,62 % je práve v tomto intervale záchytu. Porovnateľné výsledky zaznamenala talianska štúdia, ktorá prezentuje rovnako 10ročné skúsenosti. V rámci tejto štúdie bolo vyšetrených 3072 mužov s rôznymi formami neplodnosti [2]. Delécie boli v celom súbore zaznamenané v 3,2 %, v súbore nonobštruktívnej azoospermie v 8,3 %, a v súbore ťažkých oligozoospermikov v 5,5 %. Avšak len v dvoch prípadoch bola zaznamenaná delécia u mužov s hodnotou viac ako 2 milióny spermií na ml. Tieto hodnoty nie je možne v našom súbore jednoznačne konkretizovať, keďže sme mali k dispozícii len označenie oligospermia a nemali sme jednoznačne určený počet spermií na ml.

Podľa svetových literárnych údajov, ktoré boli zaznamenané počas štúdií niekoľkotisícových súborov pacientov sa zistilo, že klinicky relevantné delécie boli zaznamenané u pacientov s azoospermoiu alebo u pacientov, kde je počet spermií v ejakuláte nižší ako 1 milón na ml [3, 4, 14]. Hoci záchyt delécií je vyšší, ak sú pacienti selektovaní na základe testikulárnej histológie, nie je možné stanoviť úplne jednoznačné kritériá, ktorí pacienti majú absolvovať molekulárne vyšetrenie mikrodelécií AZF oblasti. V každom prípade koncentrácia spermií je jedným z kľúčových ukazovateľov. Mnohé laboratória, bez selekčnej kontroly pacientov, udávajú zaznamenanú frekvenciu nižšiu ako 2 %.

Pomocou PCR metódy sme využili 18 rôznych sY sekvencií s cieľom zostaviť takú sadu diagnostických sekvencií, pomocou ktorej by bolo možné zaznamenať čo najvyšší záchyt delécii v skupine slovenských pacientov. Sekvencie sme na základe publikovaných literárnych údajov a našich skúseností počas desiatich rokov menili trikrát. Prvou sadou používaných sekvencií boli: sY 129, sY 164, sY 143, sY 147, sY 254, sY 255, sY 243, sY 273, sY 158, sY 277 a sY 283. Všetky uvedené sekvencie sú z dvoch podoblastí, AZFb a AZFc. Zistilo sa, že sekvencie sY 164 a sY 273 sú repetitívne, a preto sme ich z vyšetrenia vylúčili. Do druhej skupiny používaných sekvencií sme zaradili aj sekvenciu z AZFa podoblasti (sY 85) a celá sada pozostávala z desiatich sekvencií: sY 85, sY 129, sY 139, sY 143, sY 220, sY 277, sY 283, sY 254, sY 255 a sY 158.

EAA a EMQN vytvorili smernicu pre molekulárnu analýzu mikrodelécií Y chromozómu, ktorá doporučuje vyšetriť minimálne tieto sekvencie: sY 84, sY 86, sY 127, sY 134, sY 254, sY 255 [14]. Preto sme sa rozhodli zmeniť nami používané sekvencie a postupovať podľa uvedených doporučení.

Naše výsledky dokumentujú skutočnosť, že najvyšší záchyt sme dokázali pri použití sady I, tak v súbore azoospermikov, ako aj oligospermikov. Použitím ostatných dvoch sád sme zaznamenali klesajúci záchyt predovšetkým v skupine pacientov s oligospermiou. Pri používaní sady sekvencií navrhnutej EAA, EMQN sme zistili delécie len v súbore azoospermikov. Na základe uvedených faktov sme preto navrhli diagnostickú sadu sekvencií ako kombináciu sekvencií sady I a sady III zodpovedajúcej EAA, EMQN.

Vzhľadom na skutočnosť, že sme nemali jednoznačne určený počet spermií v ejakuláte práve v skupine pacientov s oligospermiou, je možné predpokladať, že rovnako dôležitým kritériom na diagnostické účely nie je len samotný výber sekvencií, ale aj selekčné kritériá pri samotnom výbere pacientov. Práve tento faktor považujeme za kľúčový pri selekcii pacientov vhodných na vyšetrenie mikrodelécií v spomínanej oblasti a u pacientov s oligospermiou je vhodné tieto kritériá upraviť a do vyšetrení zaraďovať práve pacientov s hodnotou spermií v ejakuláte menšou ako 2 milióny na ml. Ďalšie skúsenosti budú zaujímavé predovšetkým v súbore pacientov s rôznymi formami oligospermie, kde určite upravíme selekčné kritériá pri výbere pacientov.

Čo sa týka konkrétnych typov delécií, zaznamenali sme delécie v každej z podoblastí, AZFa, AZFb, AZFc, taktiež kombinovanú deléciu AZFbc, ale aj kompletnú deléciu celej AZF oblasti. Celkovo najčastejšou podoblasťou s dokázanými deléciami v našej skupine pacientov bola podoblasť AZFc, čo je v zhode s publikovanými údajmi.

V súčasnosti je možné zisťovať výskyt delécií aj použitím setov s florescenčne značenými primermi. Na potvrdenie našich výsledkov sme sa rozhodli použiť set Devyser AZF. Pomocou tohto setu sme overili delécie v AZFc oblasti u pacientov s deléciou dokázanou pomocou niektorej nami použitých sád I, II alebo III. Môžme konštatovať, že set veľmi dobre spĺňa diagnostické kritéria, svoju úlohu však zohráva cena vyšetrenia, ktorá je oproti nami používanej PCR metóde vyššia.

Delécie AZF oblasti Y chromozómu sú špecifické v rámci diagnóz s poruchami spermatogenézy. V našom kontrolnom súbore 100 normospermických mužov sme nezaznamenali žiadne delécie. Aj keď bol jednoznačne dokázaný súvis medzi poruchami mužskej plodnosti a uvedenými deléciami, konečný potenciál plodnosti páru je ovplyvnený aj fertilizačným statusom partnerky. Z tohto hľadiska je vhodnejšie udávať, že mikrodelécie AZF oblasti Y chromozómu sú zodpovedné za oligospermiu resp. azoospermiu, než za možnú príčinu neplodnosti. Mnohé páry pred využitím rôznych foriem IVF podstupujú genetickú konzultáciu [6, 10, 12]. Napriek tomu, že nie je možné jednoznačne určiť exaktný fenotyp mužského potomstva mužov s dokázanými deléciami v nasledujúcej generácii (rôzne genetické pozadie, environmentálne faktory vplývajú na fertilizačný potenciál otcov a synov), je možné v rámci konzultácii upozorniť na niektoré skutočnosti. Delécie Yq sú spojené s instabilitou Y chromozómu a okrem možnej oligospermie resp. azoospermie existuje možné riziko vzniku anomálie 45,X0 Turnerov syndróm, alebo iných foriem mozaicizmu pohlavných chromozómov, zahrňujúcich obojpohlavné genitálie [2, 3, 11].

RNDr. Regína Behulová
Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky
Univerzita Komenského
Lekárska fakulta
Sasinkova 4
811 08 Bratislava

Doc. RNDr. V. Repiská, PhD.
Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky
LFUK a FNsP
Sasinkova 4
811 08 Bratislava
Slovenská republika
e-mail: vanda.repiska@fmed.uniba.sk