Vliv matrixových metaloproteináz na hojení ran po operaci vrozeného rozštěpu rtu

Souhrn

Cíl studie:
Cílem bylo analyzovat složky extracelulární matrix zodpovědné za hojení, především stanovit koncentrace matrixových metaloproteináz (MMP-1, MMP-2 a MMP-3) v tkáni odstraněné při operaci. Porovnat hojení ran po operaci rozštěpu rtu do sedmi dnů po narození a hojení ran po operaci podle klasického protokolu ve třech měsících věku.

Materiál a metody:
Vzorky tkáně byly odebrány od 30 dětí (16 chlapců a 14 dívek), 17 dětí bylo operováno během prvního týdne po narození a 13 dětí bylo operováno ve 2–4 měsících věku. Stanovení MMP bylo prováděno v tkáňových zbytcích získaných chirurgickou excizí okrajů rozštěpu rtu, které jsou při výkonu odstraňovány jako nadbytečné. Po odběru byla tkáň skladována zamrazením na -70 ˚C. Extrakce proběhla v kakodylátovém pufru po dobu 24 hodin při teplotě 2–8 ˚C. Ke stanovení koncentrace celkové bílkoviny v tkáni byla zvolena Lowryho metoda. Koncentrace MMP-1, MMP-2, MMP-3 byly stanovovány metodou ELISA, pomocí kitů Amersham Biotrak Activity Assay (GE Healthcare UK).

Výsledky:
MMP-1: u dětí operovaných během prvního týdne po narození byly naměřeny koncentrace 0,017 ± 0,023 µg/g bílkoviny (průměr ± SD), u dětí operovaných ve 2–4 měsících věku 0,028 ± 0,026 µg/g bílkoviny. MMP-3: u dětí operovaných během prvního týdne po narození byly naměřeny koncentrace 0,200 ± 0,142 µg/g bílkoviny, u dětí operovaných ve 2–4 měsících věku 0,155 ± 0,093 µg/g bílkoviny. Koncentrace MMP-2 byly ve všech měřených vzorcích I po zředění vyšší než horní mez koncentračního rozmezí kitů 12 µg/l.

Závěr:
Nezjistili jsme statisticky významné rozdíly v koncentracích celkové bílkoviny, či koncentracích MMP-1, MMP-2 a MMP-3 mezi skupinou dětí operovaných během prvního týdne po narození a skupinou dětí operovaných ve 2–4 měsících věku.

Klíčová slova:
matrixové metaloproteinázy, rozštěp rtu, hojení ran

ÚVOD

Hojení ran je komplexní proces, na němž se podílejí buněčné elementy a mediátory. Zahrnuje reakce mezi buňkami (neutrofily, makrofágy, monocyty, fibroblasty, keratinocyty, lymfocyty a endoteliální buňky) a mediátory (cytokiny, růstové faktory, proteázy, eikosanoidy, kininy a další), produkci buňek a mediátorů, remodelaci a zrání [1]. Ve fázi remodelace hrají významnou roli extracelulární proteázy, především serinové proteázy a matrixové metaloproteinázy (MMP) a jejich tkáňové inhibitory TIMP. MMP jsou zinek dependentní endopeptidázy degradující extracelulární matrix (ECM) a hrají klíčovou roli v její remodelaci. Tyto enzymy mohou zvýšit invazi leukocytů, regulovat zánětlivou aktivitu serinových proteáz, cytokinů a chemokinů [2]. Většina MMP je vylučována z buněk ve formě neaktivního proenzymu (zymogenu) a je aktivována extracelulárně proteinázami, malé množství může být aktivováno chemickou cestou v buňce [3]. Zvýšené koncentrace MMP a TIMP byly pozorovány v souvislosti s rupturou membrán [4].

MMP mohou být též skupinou proteinů zodpovědných za etiologii rozštěpu rtu vzhledem k jejich roli v kraniofaciální modelaci. Při vzniku rozštěpu nedochází při embryonálních faciálních procesech k úplnému spojení, neboť normální vývoj faciálního primordia vyžaduje remodelaci ECM [5]. Kromě výše zmíněného může mít koncentrace MMP a růstových faktorů v plazmě asociace s porodní hmotností, krevním tlakem a vaskulární funkcí [6].

Orofaciální rozštěpy patří k nejčastějším vrozeným vývojovým vadám a labioplastika vede k tvorbě pooperačních jizev ztěžujících socializaci pacientů.

Cílem práce bylo porovnat aspekty hojení ran po operaci rozštěpu rtu do 7 dnů po narození a hojení ran po operaci podle klasického protokolu ve třech měsících věku. Hojení sutury rtu po časné operaci se vyznačuje méně nápadnými jizvami v porovnání s hojením po pozdější operaci rtu provedené podle klasického protokolu. Hlavním cílem práce bylo analyzovat složky ECM zodpovědné za hojení, především stanovit koncentrace matrixových metaloproteináz (MMP-1, MMP-2, MMP-3) v tkáni odstraněné při operaci.

Výše zmíněné metaloproteinázy byly vybrány z důvodu jejich funkce při remodelaci ECM, a to především při štěpení kolagenu. Hojení rány je dáno mnoha faktory, přičemž jedním z nejvýznamnějších faktorů je depozice kolagenu. Fetální hojení je bezjizevnaté. Při depozici kolagenu se vyznačuje zvýšenou organizací kolagenních vláken a vyšším zastoupením kolagenu III ku kolagenu I v porovnání s dospělými jedinci, u nichž se hojení vyznačuje jizvou [7]. MMP-1 patří mezi kolagenázy a její hlavní funkcí je degradace komponent ECM, převážně kolagenu I, II a III. MMP-2 je želatináza a její hlavní funkcí je degradace denaturovaného kolagenu, především kolagenu I, II a III. MMP-3 patří mezi stromelysiny, kromě degradace ECM aktivuje řadu pro-MMP, přičemž hraje klíčovou roli při generaci aktivní MMP-1 [3].

METODY

Vzorky tkáně byly odebrány od 30 dětí (16 chlapců a 14 dívek), 17 dětí operovaných během prvního týdne po narození a 13 dětí operovaných ve 2–4 měsících věku. Analýza byla prováděna v tkáňových zbytcích získaných chirurgickou excizí okrajů rozštěpu rtu, které jsou při výkonu odstraňovány jako nadbytečné. Po odběru byla tkáň skladována zamrazením na -70 ˚C. Po rozmrazení byl vzorek tkáně v prvním kroku analýzy zvážen a extrahován v kakodylátovém pufru (kyselina kakodylová C₂H₇AsO₂ 10 mmol/l, NaCl 0,15 mol/l, CaCl₂ 20 mmol/l, ZnCl₂ 0,001 mmol/l, NaN₃ 1,5 mmol/l a 0,01% Triton X-100), kde byl homogenizován. K extrakci byl použit čtyřnásobek hmotnosti vlhké tkáně kakodylátového pufru. Extrakce probíhala 24 hodin při teplotě 2–8 ˚C. Po extrakci byl supernatant oddělen centrifugací (30 minut 13 000 g) a použit k další analýze.

Koncentrace MMP-1, MMP-2 a MMP-3 byly stanovovány metodou ELISA, pomocí kitů Amersham Biotrak Activity Assay (GE Healthcare UK). Vzhledem k dosud nepublikované koncentraci MMP v chirurgicky odstraněné tkáni dětských rozštěpů časně po narození, tj. do jednoho týdne věku novorozence, byla stanovována koncentrace celkových MMP-1 metodou ELISA (rozsah 0,1–50 ng/ml s citlivostí 0,1 ng/ml, měřeno při 405 nm). Koncentrace celkových MMP-3 byly stanovovány metodou ELISA (rozsah 0,25–32 ng/ml s citlivostí 0,1 ng/ml, měřeno při 405 nm). Koncentrace MMP-2 metodou ELISA (rozsah 0,19–12 ng/ml, citlivost 0,19 ng/ml, měřeno při 405 nm). Vzorky, u nichž byly zjištěny koncentrace MMP vyšší než deklarovaná horní mez pracovního rozsahu soupravy, byly ředěny reakčním pufrem (50mM Tris-HCl pufr pH 7,6 obsahující 1,5 mM NaCl, 0,5 mM CaCl₂, 1 µM ZnCl₂, 0,01% (v/v) BRIJ^TM 35 a 0,005% (w/v) želatinu). Naměřené koncentrace MMP-1 a MMP-3 byly následně vztaženy na koncentraci celkové bílkoviny ve vzorku.

Ke stanovení koncentrace celkové bílkoviny v tkáni byla zvolena Lowryho metoda (Na₂CO₃ 0,19 mol/l, NaOH 0,1 mol/l, CuSO₄ 0,125 mol/l, C₄H₄KNaO₆ 0,095 mol/l, Folinovo činidlo (Na₂WO₄, Na₂MoO₄, H₃PO₃, HCl, Li₂SO₄, Br), rozsah 0,01 až 1 mg/ml, 750 nm). Metoda byla validována na koncentračních hladinách 0,40 mg/ml (CV₁ = 13,43 %) a 0,85 mg/ml (CV₂ = 18,25 %).

Statistická analýza

K porovnání koncentrací MMP byl použit neparametrický nepárový t-test na hladině významnosti α = 0,05. Hodnoty p <0,05 byly považovány za statisticky významné. K vyhodnocení byl použit software GraphPad verze 5.03 (San Diego, Kalifornie).

VÝSLEDKY

Koncentrace celkových MMP-1 u dětí operovaných během prvního týdne po narození byly 0,017 ± 0,023 μg/g bílkoviny (průměr ± SD), u dětí operovaných ve 2–4 měsících věku 0,028 ± 0,026 μg/g bílkoviny. Měřením celkových MMP-3 u dětí operovaných během prvního týdne po narození byly zjištěny hodnoty 0,200 ± 0,142 μg/g bílkoviny, u dětí operovaných ve 2–4 měsících věku 0,155 ± 0,093 μg/g bílkoviny. Koncentrace MMP-2 byly ve všech měřených vzorcích i po zředění reakčním pufrem v poměru 1:1 vyšší než deklarovaná horní mez pracovního rozsahu diagnostické soupravy (>12 ng/ml). Výsledky MMP-2 tedy nelze validně statisticky vyhodnotit.

Ačkoliv je mezi průměrnými hodnotami MMP-1 a MMP-3 v obou skupinách nápadný rozdíl, nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly ani v množství celkové bílkoviny, ani v koncentracích MMP mezi oběma skupinami podle časnosti operace (neparametrický t-test; p = 0,42 (MMP-1) a p = 0,49 (MMP-3)).

DISKUSE

Naše práce se zabývá dosud nepublikovaným tématem stanovení koncentrací MMP metodou ELISA v chirurgicky odstraněné tkáni dětských rozštěpů časně po narození, tj. do jednoho týdne věku novorozence, stanovení koncentrací MMP metodou ELISA v tkáni dětských rozštěpů odstraněné během 2–4 měsíců věku a následném porovnání výsledků obou skupin.

Na základě studie Letra a spol. popisující vliv polymorfismů v promotorech genů MMP-1 a MMP-3 v souvislosti s rozštěpem rtu [5] a studie Brown a spol. popisující roli MMP-3 při vývoji patra u myší [8] a na základě prací popisujících vliv MMP na vývoj kůže během různých gestačních období [9, 10] jsme předpokládali, že koncentrace MMP v tkáni se po narození fetu mohou měnit s časem a vzhledem k roli MMP při remodelaci ECM budou mít vliv na hojení ran. Tento předpoklad vedl k hypotéze, že v tkáni odstraněné při operaci v různém čase se budou koncentrace MMP lišit.

Li a kol. ve své studii popisují vliv MMP na vývoj kůže během různých gestačních období. Bylo pozorováno, že v kůži fetů v gestačním období 12 až 18 týdnů byly vysoké hladiny MMP-2, MMP-3 a MMP-9, přičemž hladiny v období 24–40 týdnů byly v porovnání s hladinami v období 12–18 týdnů signifikantně nižší. Studie poukazuje na možnost vztahu vyšších hladin MMP-2 a MMP-3 s bezjizevnatým hojením kůže v souladu s raným gestačním obdobím [9]. Při zkoumání hojení ran v ještě ranějších fázích gestačního období u myších fetů byly pozorovány obdobně zvýšené hladiny MMP u ran hojících se bez jizvy v 16. dni gestačního období v porovnání s ranami hojícími se jizvou v 18. dni gestačního období. Maximální vzrůst exprese MMP-1 byl rychlejší a mnohem vyšší u bezjizevnatého hojení [10].

Koncentrace MMP-3 stanovené v souboru našich pacientů naznačují vyšší hodnoty u vzorků pacientů hojících se méně nápadnou jizvou (děti operované během prvního týdne po narození) v porovnání s koncentracemi vzorků pacientů hojících se jizvou (operace během 2–4 měsíců věku). Rozdíly mezi oběma skupinami však nejsou statisticky signifikantní. Koncentrace MMP-1 v tkáni dosahují nižších koncentrací u vzorků pacientů hojících se méně nápadnou jizvou v porovnání s koncentracemi pacientů hojících se jizvou, což je v rozporu s předpokladem vycházejícím z výše uvedených studií.

Ačkoliv je mezi průměrnými hodnotami MMP-1 a MMP-3 v obou skupinách nápadný rozdíl, nebyly zjištěny statisticky významné rozdíly ani v množství celkové bílkoviny, ani v koncentracích MMP mezi oběma skupinami podle časnosti operace (neparametrický t-test na hladině významnosti p = 0,42 (MMP-1) a p = 0,49 (MMP-3)). Příčinou může být malý soubor pacientských vzorků a malé množství tkáně odstraněné při excizi.

Vliv koncentrací MMP na hojení uvedené v závěrech výše uvedených studií a předpoklady, že koncentrace MMP se v tkáni odstraněné při operaci v různém čase budou lišit, naše výsledky statisticky nepotvrdily. Rozdíly v hypotéze v porovnání s výsledky naší studie mohou být dány několika technickými odlišnostmi (malé množství tkáně odstraněné při excizi, charakter zpracovávané tkáně (kůže, podkoží, sliznice), přítomnost fyziologického roztoku s roztokem adrenalinu).

Pro spolehlivou analýzu je problematické malé množství tkáně odstraněné při chirurgické excizi (průměrně 100 mg vlhké tkáně) u jednoho pacienta. Malé množství vzorku jednoho pacienta bylo limitující pro měření více druhů MMP v jednom vzorku. Tento problém byl řešen výběrem vzorků obsahujících co největší množství tkáně. Přestože byli všichni pacienti operováni jedním chirurgem stejným postupem, mohly se vyskytnout rozdíly v jednotnosti tkáně vzhledem k různé kvantitě kůže, podkoží a sliznice. Pro další měření by bylo vhodné provést separaci tkání ve vzorku na kůži, podkoží a sliznici.

Analýzu mohla dále ovlivnit přítomnost fyziologického roztoku obsahující adrenalin (na 10 ml fyziologického roztoku jedna kapka roztoku adrenalinu), který je infiltrován do tkáně při chirurgickém výkonu. Přítomnost roztoku mohla falešně zvyšovat koncentrace MMP v tkáni, nikoli však významným způsobem ovlivnit rozdíly v obou skupinách vzhledem k časnosti operace. Při dalších měřeních by proto bylo vhodné stanovit koncentrace MMP u skupiny pacientů, u nichž se neprovádí infiltrace roztoku a vyloučit tak případné pochybnosti o možnosti pozitivního ovlivnění koncentrací MMP. Přítomnost fyziologického roztoku s roztokem adrenalinu by mohla zvyšovat především nepřesnost při navážce a přepočtu množství celkové bílkoviny a MMP na vlhkou tkáň. Tyto nepřesnosti jsme eliminovali vztažením všech MMP na celkovou bílkovinu naměřenou ve vzorku.

Pro potvrzení teorie odlišnosti koncentrací MMP mezi skupinami dětí operovaných časně a podle klasického protokolu by bylo vhodné rozšířit zkoumaný soubor pacientů v obou skupinách a stanovit koncentrace a aktivity i jiných MMP.

Práce vznikla za podpory grantu IGA MZ ČR č. 10012-4.

Došlo: 29. 3. 2011

Přijato: 27. 9. 2011

Ing. Karel Bláha

Ústav klinické biochemie a patobiochemie

FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

e-mail: blaha.karel@fnmotol.cz