Role superoxiddismutázy u spinocelulárních karcinomů hlavy a krku – pilotní výsledky

Souhrn

Roli oxidativního stresu v karcinogenezi je v posledních letech věnována značná pozornost. Rovnováha mezi volnými kyslíkovými radikály a antioxidativními obrannými mechanismy hraje významnou roli při vzniku a progresi nádorů.

Cílem naší studie bylo určit vztah mezi parametry oxidativního stresu a onkologickou charakteristikou u pacientů se spinocelulárními karcinomy hlavy a krku.

Metodika:
Do studie jsme zahrnuli 75 nemocných, kteří byli operováni na KOChHK FN u sv. Anny v Brně v letech 2004-2005 pro spinocelulární karcinom hlavy a krku. Analyzovali jsme jednotlivé genové varianty polymorfismu u manganové dismutázy Ala16Val, dále její aktivitu v plazmě (p-SOD) a v erytrocytech (ery-SOD), hladinu tumor nekrosis faktoru a malondialdehydu (MDA) v plazmě jako markeru lipoperoxidace.

Výsledky:
U N0 pacientů (n=30) jsme zjistili nižší hladinu p-SOD než u nemocných N+ (n=45, p=0,02, Mann-Whitney). Hladina MDA byla vyšší u pacientů, u kterých se během 22 měsíců po navození kompletní remise objevila recidiva (n=13), než u nemocných, kteří zůstali v kompletní remisi (n=58, p=0,06, Mann-Whitney). Pacienti s plazmatickou hladinou MDA < 0,25nmol/g měli delší bezpříznakový interval než nemocní s vyšší MDA (log rank test, p = 0,01). Riziko recidivy u nemocných s MDA < 0,25 nmol/g v našem souboru bylo 8,0%, na rozdíl od pacientů s MDA > 0,25 nmol/g s rizikem vzniku recidivy 42,9% (χ² test, p = 0,01). Pacienti s plazmatickou hladinou SOD > 1,30 kU/g mají v 77,1 % lokoregionální diseminaci do krčních uzlin na rozdíl od pacientů s SOD < 1,30 kU/g s 49,7% rizikem metastatického rozsevu do krčních uzlin (χ² test, p = 0,03).

Závěr:
Výsledky naší studie ukazují na významnou roli oxidativního stresu v onkologii hlavy a krku. Potvrzení předběžných výsledků na větším souboru by mohlo mít významné důsledky pro klinickou praxi. Zejména prognostický význam MDA pro recidivování a význam plazmatické aktivity SOD jako markeru metastatického potenciálu je nutné potvrdit dalším výzkumem.

Klíčová slova:
oxidativní stres, karcinomy hlavy a krku, superoxiddismutáza, malondialdehyd, metastatický potenciál, prognostický faktor.

ÚVOD

Role oxidativního stresu v onkogenezi je dnes experimentálně poměrně dobře doložena (1, 8). Řada autorů se v posledních letech věnovala vztahu oxidativní zátěže k riziku, vzniku a prognóze rakoviny. Bylo popsáno několik úrovní tohoto vztahu. Prvořadá je jednak schopnost volných radikálů (VR) oxidačně poškozovat DNA, mutace v kritických místech genomu - v protoonkogenech, supresorových a reparačních genech - jsou v jasném vztahu s karcinogenezí. Navíc většina maligních buněk postrádá fyziologickou schopnost vypořádat se s oxidativním stresem kvůli změněné aktivitě antioxidačních enzymů (AOE). Spinocelulární karcinomy hlavy a krku jsou úzce spjaty s oxidativním stresem, protože alkohol a kouření, jako zdroje masivní oxidativní zátěže, jsou považovány za etiologické faktory těchto malignit (4).

Oxidativní stres můžeme definovat jako stav nerovnováhy mezi produkcí volných kyslíkových radikálů (VR) a jejich neutralizací antioxidačními enzymy ve prospěch produkce VR. VR pohotově reagují s buněčnými strukturami díky přítomnosti jednoho nebo více nepárových elektronů. Mezi VR se řadí superoxid, hydrogenperoxid, hydroxylový radikál, singletový kyslík aj. Produkce VR je zprostředkována endogenními i exogenními činiteli. Mezi nejdůležitější exogenní zdroje VR patří kouření a ozón. Mitochondrie, zejm. imunitních buněk (eozinofily, alveolární makrofágy, atd.), jsou významným endogenním zdrojem VR. I za fyziologických podmínek reagují ojedinělé elektrony nevyužité v dýchacím řetězci mitochondrií s kyslíkem za tvorby superoxidu. Účinkem superoxiddismutázy (SOD) je superoxid měněn v hydrogenperoxid a ten později neutralizován katalázou v peroxizomech a glutationperoxidázou v cytoplazmě a mitochondriích. Nejsou-li VR neutralizovány dostatečně rychle antioxidačními enzymy nebo neenzymatickými antioxidanty, dochází k poškození intracelulárních struktur – DNA, proteinů a buněčných membrán (18). Dochází k oxidaci proteinů, lipoperoxidaci fosfolipidů buněčných membrán (za produkce malondialdehydu (MDA), jehož hladina tak vypovídá o míře expozice tkání oxidativnímu stresu), a jednořetězcovým zlomům DNA.

Manganová superoxiddismutáza (SOD) je exprimována v mitochondriích téměř všech aerobních organismů, kde zahajuje antioxidační obranu neutralizací vznikajících superoxidových radikálů. Gen pro SOD (SOD2) je lokalizován na dlouhém raménku 6. chromozomu (6q25.3). Shimoda-Matsubayashi popsal záměnu alaninu (GCT) za valin (GTT) v pozici -9 signálního peptidu, v důsledku které dochází ke změně aktivity SOD (7, 17).

V naší práci jsme se zaměřili na studium vztahu mezi genetickou variabilitou SOD2, cirkulujícími hladinami markerů oxidativního stresu – plazmatickou a erytrocytární SOD (p- a ery-SOD), TNFá a MDA - a rozsahem primárního onemocnění, odpovědí na terapii a délkou pooperačního přežívání. Konkrétními cíli studie bylo (i) srovnat distribuci genotypů a alel polymorfismu v SOD2, aktivitu SOD v plazmě a v erytrocytech a hladiny MDA a TNF u pacientů s lokálním rozsevem do krčních uzlin v době diagnózy a bez něj (tj. diagnostický význam) a pomocí následného prospektivního sledování (i) zjistit vztah mezi těmito parametry a délkou setrvání v kompletní remisi (tj. prognostický význam). 

OSOBY A METODY

Soubor pacientů

Do prospektivní studie bylo zahrnuto celkem 75 pacientů (64 mužů, 11 žen, průměrný věk 59,6  ± 8,9 roku, minimální a maximální věk 33 a 83 let) s diagnózou spinocelulárního karcinomu hlavy a krku léčených na Klinice otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku FN u sv. Anny v Brně od července 2004 do srpna 2005. Průměrná (ev. mediánová) doba pooperačního sledování byla 17,4 (16,0) měsíců. Primární tumor byl zjištěn v následujících lokalizacích: 12 spodina ústní dutiny, 5 jazyk, 19 orofarynx, 7 hypofarynx, 29 hrtan a 1 nosní přepážka; i přes náležité vyšetření u 2 pacientů s potvrzenými metastázami do krčních uzlin nebyl nalezen primární tumor. Tabulka 1 ukazuje rozdělení pacientů podle TNM klasifikace. Histologicky se u 16 nemocných jednalo o dobře diferencovaný, u 41 středně diferencovaný a u 15 nízce diferencovaný karcinom; u zbývajících 3 vzorků nebylo možné histologicky přesněji určit stupeň diferenciace. Studie byla schválena Etickou komisí Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně. Všichni pacienti podepsali před zařazením do studie informovaný souhlas. 

Genetické vyšetření

Vyšetřovali jsme genetický polymorfismus Ala/Val v pozici -9 (signální peptid) sekvence genu SOD2. DNA byla izolována standardní metodou využívající proteinázu K z leukocytů periferní krve odebrané 7. den po chirurgické resekci nádoru. Stanovení genotypu Ala-9Val bylo provedeno polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) následovanou štěpením amplikonu restrikční endonukleázou podle popsané metody (9). Stručně, PCR amplifikovala fragment o délce 249bp s využitím dvojice specifických oligonukleotidů FW 5‘-AGCCCAGCCGTGCGTAGAC-3‘ a REV 5‘-TACTTCTCCTCGGTGACG-3‘. PCR produkt byl štěpen enzymem BsaWI (New England BioLabs), vzniklé fragmenty o délce 249bp pro Ala-9 alelu a 87 + 162bp pro Val-9 alelu byly elektroforeticky separovány v 2% agarózovém gelu a vizualizovány UV světlem.

Stanovení SOD a MDA

Aktivita p- a ery-SOD byla měřena kalorimetrickou metodou založenou na kvantifikaci nedismutovaného superoxidu tetrazoliovou solí komerčně dostupným kitem (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI) po inhibici ostatních izoforem superoxiddismutázy 1mM kyanidem draselným. Celkový MDA jsme měřili po jeho derivaci thiobarbiturovou kyselinou pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s použitím fluorescenční detekce (11). Hladina TNFá byla stanovována komerčně dostupným ultrasenzitivním ELISA kitem (BioSource, Camarillo, CA).

Statistické metody

Hardy–Weinbergova rovnováha a testování rozdílu významnosti ve frekvencích genotypů, resp. alelických frekvencích, bylo provedeno ÷² test a Fisher-exact testem. K porovnání ostatních proměnných byly použity běžné neparametrické testy (Mann-Whitney, Kruskal-Wallis ANOVA a Spearmanovy korelační koeficienty). Ke srovnání délky bezpříznakového intervalu v závislosti na genotypu SOD2 jsme použili Kaplan-Meierovu analýzu přežívání a log-rank test. Hladinu P<0,05 jsme považovali za statisticky signifikantní. Veškeré statistické analýzy jsme provedli pomocí statistického programu STATISTICA for Windows v 7.1 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA). 

VÝSLEDKY

Rozsah primárního onemocnění versus sledované parametry

Srovnali jsme distribuci genotypů a alel SOD2 a hladiny p-SOD, ery-SOD, MDA a TNFá mezi skupinami definovanými rozsahem primárního onemocnění podle TNM klasifikace. Při srovnání pacientů s negativním nálezem na krku v době diagnózy (N0, n=30) a nemocných s lokoregionálním metastatickým rozsevem do krčních uzlin v době diagnózy (N+, n=45) jsme zjistili  významně nižší aktivity p-SOD u skupiny N0 (p=0,02, Mann-Whitney) (graf 1). Hladina p-SOD korelovala s rostoucím rozsahem postižení regionálních uzlin (p=0,007, Spearman). Další parametry se signifikantně nelišily u pacientů s rozdílným postižením krčních uzlin (p>0,05, Mann-Whitney). 

Diagnostická hodnota p-SOD při určení rizika metastatického postižení krčních uzlin

Pacienti s aktivitou p-SOD > 1,30 kU/g proteinu mají v 77,1 % lokoregionální diseminaci do krčních uzlin v čase stanovení diagnózy (95% interval spolehlivosti 66,2 - 86,2%). Nemocní s aktivitou p-SOD < 1,30 kU/g proteinu jsou vystaveni 49,7% riziku metastatického rozsevu do krčních uzlin (95 % interval spolehlivosti 37,6 - 61,1%). Tento rozdíl je statisticky významný (÷² test, p = 0,03). Jinými slovy, pacienti s plazmatickou aktivitou SOD > 1,30 kU/g proteinu mají téměř dvojnásobné (77,1 % vs. 49,7 %) riziko metastatického šíření nádoru do krčních uzlin v čase stanovení diagnózy.

Výsledek prospektivního sledování a srovnání skupin

Z celkového počtu 75 osob 4 nedosáhly úvodní terapií kompletní remise, zbylých 71 ano. Po dobu následujících 22 měsíců zůstalo 58 pacientů v kompletní remisi (skupina A), 13 recidivovalo (skupina B). Srovnání genotypů SOD2 a vyšetřovaných plazmatických parametrů  mezi oběma skupinami ukazuje tab. 2. Při porovnání obou skupin jsme nenalezli statisticky významný rozdíl v plazmatických hladinách žádného ze sledovaných působků (Mann-Whitney), pouze u MDA byly hladiny statisticky hraničně významně vyšší u skupiny B vs. A (p=0,06) (graf. 2). Podobně jsme nenalezli významný rozdíl ve frekvencích genotypů, resp. alel SOD2 (p>0,05, ÷² test, Fisher-exact). Rozložení genotypů polymorfismu Ala-9Val bylo v souladu s Hardy-Weinbergovým equilibriem (p>0,05, ÷² test). Alelické frekvence v celkovém souboru byly téměř totožné s rozložením alel ve skupinách A a B – 58 % pro alanin a 42 % pro valin. Ve skupině 4 pacientů, kteří nedosáhli kompletní remise, ale bylo rozložení 12 % pro alanin a 88 % pro valin, viz tab. 3. V tomto srovnání tedy nemocní, kteří dosáhli kompletní remise vs. těch, kteří jí nedosáhli, jsme prokázali statisticky významný rozdíl v distribuci genotypů (p=0,01) i alel (p=0,01, ÷² test) polymorfismu SOD2 Ala/Val. Nicméně vzhledem k velmi nízkému počtu pacientů v jedné ze skupin je nutno brát tyto výsledky s rezervou. Hladiny ery-SOD, MDA, ani TNF se významně nelišily mezi nositeli jednotlivých genotypů sledovaného polymorfismu (p>0,05, Kruskal-Wallis). Jedinou výjimkou byla aktivita p-SOD, jejíž hladina byla významně vyšší u homozygota Val/Val (p=0,05, Kruskal-Wallis) (graf. 3).

Analýza délky bezpříznakového intervalu ve vtahu ke sledovaným parametrům

Srovnání doby do relapsu choroby (definována jako délka bezpříznakového intervalu po dosažení úvodní remise, angl. DFI, disease-free interval) mezi nosiči jednotlivých genotypů SOD2 bylo provedeno pomocí Kaplan-Meierovy analýzy přežívání.  Osoby v kompletní remisi po celou dobu studie byly definovány jako „cenzurované odpovědi“, osoby recidivující jako „kompletní odpovědi“, DFI byl udán v měsících, genotyp Ala-9Val označen kódy 1=Ala/Ala, 2=Ala/Val, 3=Val/Val. Při srovnání všech tří skupin jsme nenalezli významný rozdíl (p>0,05). Post-hoc srovnání log-rank testem neprokázalo tendenci naznačenou na grafu. 4, že nositelé varianty Val/Val měli delší DFI (kód 1 vs 2 p=0,89, 1 vs 3 p=0,47, 2 vs 3 p=0,33, vše log rank test). 

Prognostický význam plazmatické hladiny MDA

Při srovnání délky bezpříznakového intervalu (disease free interval) u pacientů s plazmatickou hladinou MDA < 0,25 nmol/g proteinu s nemocnými s MDA > 0,25 nmol/g proteinu jsme mezi oběmi skupinami objevili statisticky významný rozdíl  (log rank test, p = 0,01). Riziko recidivy u pacientů s MDA < 0,25 nmol/g proteinu v našem souboru je 8% (95% interval spolehlivosti 2-19%). Naopak nemocní s MDA > 0,25 nmol/g proteinu mají riziko vzniku recidivy 42,9% (95% interval spolehlivosti 29-56%). Rozdíl mezi oběma skupinami pacientů ve výskytu recidiv v prvních 22 měsících byl statisticky významný (÷² test, p = 0,01). V naší studii tedy měli nemocní s perioperační hladinou MDA > 0,25 nmol/g proteinu vyšší riziko recidivy (8,0 % vs. 42,9 %) v prvních 22 měsících po navození kompletní remise (graf. 5).

DISKUSE

Naše výsledky potvrzují významnou roli oxidativního stresu v karcinogenezi. Plasmatická hladina MDA jako produktu lipoperoxidace korelující s expozicí buňky oxidativnímu stresu je zvýšená u recidivující nemoci pravděpodobně díky zhoršené efektivitě antioxidační obrany (8, 14). Několik autorů popsalo intenzivnější lipoperoxidaci a nižší aktivity AOE u pacientů s karcinomy hlavy a krku (10, 12, 14, 16, 21). Navíc samotná nádorová tkáň uvolňuje obrovské množství volných radikálů. Po chirurgické resekci nádoru dochází k poklesu lipidové peroxidace a zvýšení aktivity AOE (2, 20). Hrizostov dokonce 10 - 20 dní po resekci tumoru zjistil normalizaci hodnot MDA v plazmě (6). Naopak Samir popsal elevaci produktů lipoperoxidace 3 týdny po laryngektomii (15). Naše výsledky nás opravňují předpokládat, že pokročilejší stadia nádorů jsou doprovázena vyšší mírou oxidativního stresu. Tyto závěry jsou v souladu s prací Szuster-Ciesielské, která zjistila zvýšenou hladinu VR korelující se stadiem u laryngeálního karcinomu (20). Podobně Yigitbasi popsal  nepřímou úměru mezi aktivitou SOD a stupněm diferenciace (22).

Je zajímavé, že Bohn nezjistil rozdílnou hladinu oxidativního stresu měřenou ihned po ukončení kurativního ozáření a 6 týdnů poté (4). V souladu s dostupnými literárními zdroji se domníváme, že nádorová tkáň je významným zdrojem VR, a tím by během destrukce nádorové tkáně radioterapií mělo docházet k poklesu VR podobně jako po chirurgické resekci tumoru (6). Naopak samotná radioterapie je zdrojem masivní oxidativní zátěže. Z předchozího plyne, že snížení produkce VR nádorovými buňkami je během ozařování substituováno oxidativním stresem vyvolaným radioterapií (3, 13, 19).

Předpoklad geneticky podmíněné schopnosti onkologického pacienta posílit antioxidační obranu v situaci zvýšené tvorby VR nádorovou tkání byl publikován Genkingerem. Pozoroval nižší riziko vzniku rakoviny obecně u heterozygotů Ala/Val (5) v souboru 6151 dárců krve. Naše výsledky však neukazují na přímý vztah mezi určitým genotypem a incidencí malignit. Ze získaných dat vyvozujeme, že kromě genetických vlivů hrají v karcinogenezi roli i mnohé zevní faktory.

Námi zjištěný významný rozdíl v plazmatické aktivitě SOD u pacientů s rozdílným nádorovým postižením uzlin je velmi významný. Aktivita SOD je reaktivně posílená ve stavu zvýšené oxidativní zátěže. Otázkou zůstává kauzalita vztahu oxidativního stresu a aktivity tohoto enzymu. Je možné, že pacienti vystavení vyšší oxidativní zátěži mají větší tendenci k tvorbě metastáz do krčních uzlin. Pravděpodobná je i interpretace, že zvýšená produkce VR vede ke zvýšení metastatického potenciálu. Zatím ani my, ani jiní autoři nenabízejí uspokojivé vysvětlení tohoto jevu popsaného i Szuster-Ciesielskou, která pozorovala korelace hladin markerů oxidativního stresu s klinickým stadiem u karcinomů hrtanu (20).

Diagnostický přínos má námi zjištěné téměř dvojnásobně vyšší riziko metastatického šíření nádoru do krčních uzlin v čase stanovení diagnózy u pacientů s aktivitou plazmatické SOD vyšší než 1,3 kU/g. Tento přínos se ale snižuje srovnáním rizik. Bloková krční disekce by byla nutná jak při 49%, tak při 77% riziku metastáz do krčních uzlin. Přesto má plazmatická aktivita SOD diagnostický význam, i když zatím bez klinického dopadu.

Elevace hladiny MDA jako produktu lipoperoxidace u pacientů s recidivou nás opravňuje vyvodit závěr, že nemocní, kteří jsou vystaveni zvýšené oxidativní zátěži, čelí vyššímu riziku recidivy. Rozložení alel se nelišilo mezi těmi, u kterých se po kompletní remisi vyvinula recidiva, a těmi, kteří zůstali v kompletní remisi. Lišilo se pouze zastoupení genetických variant u skupiny, která vůbec nedosáhla kompletní remise. Interpretace je zde ale obtížná vzhledem k nízkému počtu pacientů v této podskupině.

Analýzou délky bezpříznakového intervalu jsme neprokázali statisticky významné rozdíly mezi jednotlivými genetickými variantami sledovaného polymorfismu. I když graf 4 naznačuje takovou tendenci, k jejímu průkazu nebo vyvrácení bude nutné zpracovat větší soubor. Histogram plazmatických hladin MDA se dvěma maximy nás vedl k rozdělení souboru pacientů na skupinu s MDA vyšším než 0,25 nmol/g proteinu a skupinu s MDA nižším. Obě skupiny měly výrazně rozdílnou délku bezpříznakového období. Dokonce odhad rizika vzniku recidivy v období téměř 2 let  po navození kompletní remise je u pacientů s MDA nižším než 0,25 nmol/g  proteinu 5-6krát nižší než u nemocných s vyšším MDA (8 % vs. 43 %).

Naše výsledky poukazují na významný diagnostický i prognostický potenciál parametrů oxidativního stresu. Zejména plazmatická hladina MDA získaná v časném pooperačním období nepřímo korelující s délkou bezpříznakového období je klinicky velmi významná. Podobné výsledky zatím nebyly popsány v dostupné literatuře. Podaří-li se potvrdit tato závislost parametrickými statistickými metodami na větším vzorku pacientů, pak by se MDA mohl stát prvním klinicky významným prognostickým markerem v onkologii hlavy a krku.

Zvýšená aktivita SOD korelující s rozsahem metastatického postižení krčních uzlin poukazuje na SOD jako potenciální diagnostický marker metastatického potenciálu. Téměř dvojnásobné zvýšení rizika metastatické diseminace u pacientů s vysokou plazmatickou hladinou SOD (77,1% vs. 49,7%) nemá natolik významné klinické následky. Dle našich výsledků by se stanovení vysoké aktivity SOD mohlo stát jenom pomocným markerem při indikování elektivních blokových krčních disekcí. 

ZÁVĚR

Významným závěrem naší práce je nález korelace mezi aktivitou superoxiddismutázy a metastatickým potenciálem karcinomů hlavy a krku. Podaří-li se potvrdit tento vztah na větším souboru, bude možné indikovat elektivní blokové disekce u pacientů s vysokou aktivitou tohoto enzymu. Naopak pacienti s nízkou aktivitou by mohli být ušetřeni komplikací spojených s operací lymfatického systému krku. Dalším závěrem naší práce je nález potenciálního prognostického markeru. V onkologii hlavy a krku zatím postrádáme marker odebraný v perioperačním období, který by nám zařadil pacienta do skupiny s vyšším rizikem recidivy. Jeho skutečnou hodnotu bude ještě nutné potvrdit dalším výzkumem na větším souboru.

Poděkování

Práce vznikla s finanční podporou grantu IGA MZ ČR 10/II NR/7996-3.

Použité zkratky:

AOE – antioxidativní enzymy, MDA - malondialdehyd, MDA/BK – hladina malondialdehydu přepočtená na množství proteinu v plazmě, SOD - manganová superoxiddismutáza, p-SOD – plazmatická superoxidismutáza, ery-SOD – superoxiddismutáza v erytrocytech, p-SOD/BK – plazmatická aktivita superoxidismutázy přepočtená na množství proteinu v plazmě, TNFá – tumornekrotizující faktor alfa, VR - volné kyslíkové radikály

Došlo 18. 9. 2006 

MUDr. Richard Salzman

Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku

LF MU a FN u sv. Anny

Pekařská 53

625 00  Brno