Vplyv laserového žiarenia rôznych intenzít na hojenie incíznych rán u zdravých a diabetických potkanov

Súhrn

Úvod:
Optimálne parametre laserového žiarenia s nízkou intenzitou používaného v terapii hojenia rán (LLLT) neboli doteraz exaktne experimentálne určené. V literatúre boli publikované údaje o tom, že dávka 5 J/cm² je potenciálne schopnou urýchliť proces hojenia rán u pacientov. Stále však nebol určený optimálny spôsob dodania energie rane. leda nebola určená optimálna intenzita aplikovaného laserového žiarenia. Preto cieľom našej štúdie bolo porovnať rôzne intenzity výkonov laserového žiarenia používaných pri LLLT.

Materiál a metódy:
Do štúdie bolo zaradených 16 samcov potkanov z rodu Sprague-Dawley. ktoré boli náhodne rozdelené do 2 skupín: skupina zdravých potkanov a potkany po indukcii diabetes mellitus streptozotocínom. V celkovej anestézii boli za aseptických podmienok na chrbte experimentálnych zvierat vykonané štyri kožné incízie, ktoré boli následne zošité pokračujúcim intradermálnym stehom. Tri zo štyroch rán boli denne stimulované diódovým laserom (vlnová dĺžka 635 nm, denná dávka 5 J/cm², intenzity 1 mW/cm², 5 mW/cm² a 15 mW/cm²), vždy tá istá rana žiarením s tou istou intenzitou, kým štvrtá rana slúžila ako kontrola. Šesť dní po výkone boli zvieratá usmrtené a vzorky kožných rán boli odobraté na histologické vyšetrenie.

Výsledky:
Naša štúdia ukázala, že LLLT pozitívne ovplyvňuje proces hojenia rán. Najsignifikantnejšie zmeny boli pozorované pri najvyššej intenzite 15 mW/cm². Keďže pri použití laserového žiarenia s najvyššou intenzitou je potrebný na dosiahnutie takej istej dennej dávky 5 J/cm² najkratší čas, veríme, že intenzita laserového žiarenia 15 mW/cm² bude optimálnym parametrom pre terapiu u pacientov.

Kľúčové slová:
hojenie rán – LLLT – diabetes mellitus – diódový laser

_ÚVOD

Vo svete sa odhaduje, že chorobnosť spojená s oneskorením hojenia rán zvyšuje náklady na služby spojené so zdravotnou starostlivosťou o 9 miliárd dolárov ročne [1]. Existuje celý rad vplyvov, známych alebo neznámych, ktoré negatívne ovplyvňujú kvalitu procesov prebiehajúcich pri hojení rán. Medzi faktory, negatívne ovplyvňujúce priebeh hojenia rán patrí aj diabetes mellitus. Poruchy hojenia pri diabetes mellitus sú multifaktoriálne a sú dôsledkom abnormálnych zápalových pochodov, porúch ciev zahŕňajúcich mikro- a makroangiopatiu, periférnej neuropatie, porúch funkcie granulocytov, makrofágov a keratinocytov [2]. Podľa niektorých autorov 15 % diabetických pacientov trpí počas života komplikáciami pri hojení rany [3].

Preto je dôležité hľadať nové alternatívy na zlepšenie hojenia po operáciách a úrazoch. Jedným zo spôsobov ako ovplyvniť priebeh hojenia je použitie laserového žiarenia s nízkou intenzitou – LLLT (Low-Level Laser Therapy). Je dokázané, že účinok LLLT na rôzne typy rán závisí od použitej vlnovej dĺžky, intenzity žiarenia a celkovej dávky, avšak ideálne parametre pre jednotlivé typy rán neboli dodnes popísané [4, 5].

Cieľom tejto práce bolo stanoviť vplyv rôznych intenzít (1 mW/cm², 5 mW/cm² a 15 mW/cm²) laserového žiarenia s vlnovou dĺžkou 635 nm pri zachovaní rovnakej dennej dávky (5 J/cm²) na hojenie incíznych rán u zdravých a diabetických potkanov a čiastočne tak optimalizovať jeden z parametrov nízkointenzitnej laseroterapie.

_METÓDY

Do súboru boli zaradené samce potkanov zrodu Sprague-Dawley (n = 16). Zvieratá boli náhodne rozdelené do 2 skupín (skupina zdravých potkanov a skupina s indukovaným inzulín-dependentným diabetes mellitus). V každej skupine bolo po 8 zvierat. V skupine potkanov s indukovaným inzulín-dependentným diabetes mellitus bol podaný streptozotocín (Streptozotocín, Sigma – Aldrich, USA) (15 mg/ml vo fosfátovom pufri, pH 5,5) v dávke 60 mg/kg 6 týždňov pred začatím experimentu jednorázovo intraperiloneálne. Glykémia bola meraná 48 hodín po podaní streptozotocínu z venóznej krvi chvostovej vény potkana pomocou glukomeru (Bioland G 423, Compex – Slovakia, Slovenská republika). Do experimentu boli zaradené potkany s hodnotou glykémie 12 mmol/1 a vyššou. Zvieratám boli aplikované subkutánne raz denne 2 IU inzulínu s dlhodobým účinkom (Insulin HM – NPH, Zentiva, Česká republika).

Celková anestézia bola indukovaná intramuskulárnym podaním kombinácie ketamínu (Narkamon, Spofa, Česká republika) v dávke 30 mg/kg, xylazínu (Rometar a.u.v., Spofa. Česká republika) v dávke 10 mg/kg a tramadolu (Tramadol-K, Krka, d.d Novo Mesto, Slovinsko) v dávke 5 mg/kg. Ako premedikácia bol podkožné aplikovaný atropín (Atropin, Biotika, Slovenská republika) v dávke 0,05mg/kg. Na chrbtoch experimentálnych zvierat boli za aseptických podmienok vykonané štyri 2 cm dlhé kožné incízie, rovnobežné s chrbticou, ktoré boli následne zošité pokračujúcim intradermálnym stehom materiálom Chirallon 5/0 (Chirmax a.s., Česká republika). Rany tvorili kraniálne a kaudálne časti dlhších laterálnych stien mysleného obdĺžnika (4x7 cm).

Biostimulácia bola uskutočňovaná pomocou diódového lasera (MAESTRO) s vlnovou dĺžkou 635 nm. Jedna zo štyroch rán vždy slúžila ako kontrola, zatiaľ čo ostatné boli ožarované laserovým žiarením s tromi rozdielnymi intenzitami – 1 mW/cm², 5 mW/cm² a 15 mW/cm² pri celkovej dennej dávke 5 J/cm², vždy tá istá rana tou istou intenzitou. Rany boli ožarované denne 3krát až do odoberania vzoriek.

Vzorky na histopatologické vyšetrenie boli odoberané v oboch skupinách po 144 hodinách od operácie okamžite po usmrtení zvierat éterom vo zvone. Rany boli rutinne spracované pre svetelnú mikroskopiu a rezy boli farbené hematoxylín-eozínom (HR) a farbením podľa van Giesona (VG). Preparáty boli semikvantitatívne vyhodnocované metódou dvojitého slepého pokusu [4, 9, 10]. Sledované boli morfologické zmeny ako reepiteliácia, prítomnosť buniek akútnej zápalovej odpovede (PMNL), prítomnosť tkanivových makrofágov, migrácia a proliferácia fibroblastov, neoangiogenéza a prítomnosť novovytvoreného kolagénu v incízii. Výsledky, získané pri semikvantitatívnom hodnotení histologických preparátov sme štatisticky analyzovali pomocou Kruskal-Wallisovej neparametrickej jednofaktorovej analýzy rozptylu, pričom za signifikantné sme pokladali výsledky, pri ktorých p < 0,05. Všetky pokusy boli v súlade s etickými štandardami a schválené Štátnou veterinárnou a potravinovou správou Slovenskej republiky a etickou komisiou Lekárskej fakulty Univerzity P. J. Šafárika.

_VÝSLEDKY

I. skupina – zdravé potkany

V skupine zdravých zvierat sme pozorovali 144 hodín od operácie kompletné ukončenie procesu regenerácie a keratinizácie epidermis ako v kontrolných ranách (Obr. 1a/1), tak aj v ranách stimulovaných laserovým žiarením s tromi rozdielnymi vyššie uvedenými intenzitami, bez signifikantných rozdielov. Akútna zápalová fáza boli vo všetkých ranách ukončená. Tkanivové makrofágy boli zastúpené v rovnakom množstve vo všetkých ranách. V zastúpení fibroblastov (Obr. 1c/2) bolo pozorované signifikantné zvýšenie ich množstva (p < 0,05) v ranách ožarovaných laserovým žiarením s intenzitou 5 mW/cm² a 15 mW/cm² oproti kontrolným ranám (Obr. 1a/2). Vo všetkých stimulovaných ranách prevažovalo horizontálne usporiadanie fibroblastov (Obr. 1c/1). Počet novotvorených ciev bol signifikantné vyšší vranách ožarovaných laserovým žiarením s intenzitou 5 mW/cm² a 15 mW/cm² (Obr. 1d/1) oproti ranám ožarovaným žiarením s intenzitou 1 mW/cm² a kontrolným ranám (p < 0,05). V množstve kolagénu neboli zaznamenané medzi kontrolnými a laserom stimulovanými ranami signifikantné rozdiely.

II. skupina – skupina s indukovaným inzulín-dependentným diabetes mellitus

V skupine diabetických potkanov sme pozorovali premostenie priestoru incízií súvislým epitelom, usporiadaným do viacerých vrstiev. Proces regenerácie epidermis bol v tejto skupine spomalený, čo sa prejavilo menšou hrúbkou novotvoreného epitelu. Medzi kontrolnými a laserom stimulovanými ranami a ani medzi laserom stimulovanými ranami navzájom nebol zaznamenaný v tomto parametri signifikantný rozdiel. Priebeh zápalovej fázy bol u diabetických potkanov spomalený. Bolo však možné pozorovať rýchlejší ústup (p < 0,05) zápalovej fázy v ranách liečených laserovým žiarením s intenzitou 5 a 15 mW/cm² (Obr. 2d/l) oproti kontrolným ranám (Obr. 2a/l), bez signifikantných rozdielov medzi použitými intenzitami laserového žiarenia. Fibroblasty boli v signifikantne vyššom počte (p < 0,05) v ranách ožiarených laserovým lúčom s intenzitou 15 mW/cm² (Obr. 2d/2) oproti kontrolným ranám. Neoangiogenéza bola najviac zastúpená v spodine rán ožarovaných laserovým žiarením s intenzitou 5 mW/cm² a 15 mW/cm² (Obr. 2c/1) v porovnaní s intenzitou 1 mW/cm² (Obr. 2b/l) a kontrolnými ranami (p < 0,05). V množstve kolagénu neboli medzi kontrolnými a stimulovanými ranami väčšie rozdiely.

_DISKUSIA

Aj v súčasnosti, na začiatku 21. storočia predstavuje hojenie infikovaných, diabetických, steroidmi či iným spôsobom alterovaných rán veľký problém. Moderná medicína preto stále hľadá rôzne liečebné modality s pozitívnym vplyvom na priebeh hojenia rán, medzi ktoré patrí vplyv rôznych farmakologických prípravkov [1, 7], elektrickej stimulácie [8], alebo ultrazvuku [9] a iné [10].

V našej štúdii sme použili diódový laser s vlnovou dĺžkou 635 nm a dennou dávkou 5 J/cm². Táto vlnová dĺžka je veľmi podobná vlnovej dĺžke najčastejšie používaného He-Ne lasera. Pri stanovení uvedenej dennej dávky sme vychádzali z viacerých prác [5, 14]. Stadler a kol. dokázal u incizionálneho modelu hojenia pozitívny efekt laserového žiarenia s vlnovou dĺžkou 830 nm pri dávke 5 J/cm² na pevnosť rany u myší [14].

V našej štúdii sme nezaznamenali po 144 hodinách hojenia významné rozdiely v procese regenerácie epidermis medzi kontrolnými a laserom stimulovanými ranami v zhode s našimi predchádzajúcimi pozorovaniami [12]. V skupine diabetických potkanov bolo možné pozorovať rýchlejší ústup zápalovej fázy v laserom liečených ranách v súlade s inými prácami [11, 15, 16, 17]. V oboch skupinách sme pozorovali zvýšenie proliferácie a aktivácie fibroblastov a zvýraznenie neoangiogenézy v laserom liečených ranách, čo koreluje s výsledkami iných autorov a našimi predchádzajúcimi pozorovaniami [6, 11, 13, 16, 17]. Najvýraznejšie zmeny v týchto parametroch bolo možné pozorovať v ranách ožarovaných laserovým lúčom s intenzitou 5 a 15 mW/cm². V depozícii kolagénu sa nám nepodarilo nájsť v laserom stimulovaných ranách signifikantný rozdiel, čo protirečí tvrdeniam niektorých autorov [8, 16]. Túto diskrepanciu dávame do súvislosti s modelom hojenia, keďže všetci títo autori použili vo svojich štúdiách model sekundárneho hojenia rany, ktorý je pre stanovovanie množstva kolagénu vhodnejší [18].

Z našich výsledkov môžeme predpokladať, že pre terapiu kožných rán u pacientov bude najvhodnejšie použiť laserové žiarenie s intenzitou 15 mW/cm², keďže umožní dosiahnuť požadovanú dennú dávku za najkratší čas, čo zníži časové nároky na personál a súčasne vytvorí priestor pre liečbu väčšieho počtu pacientov. Pre pokračovanie tejto pilotnej štúdie bude potrebné vyhodnotiť iné dni hojenia, použiť aj sekundárny model hojenia rany a ďalšie metódy vyhodnotenia.

_POĎAKOVANIE

Na záver ďakujeme študentom Filipovi Deptovi a Marekovi Antolovi za pomoc pri ožarovaní laboratórnych zvieral a Magdaléne Mainušovej za zhotovenie histologických preparátov.

Prof. MUDr J. Bober, CSc.

I. chirurgická klinika LF UPJŠ

Tr. SNP 1

040 66 Košice.

Slovenská republika

e-mail: nemcova@lf.upjs.sk