Analýza vztahu volných lehkých řetězců κ/λ a páru těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu ke stratifikaci mnohočetného myelomu podle Mayo Stratification of Myeloma and Revised International Staging System

Souhrn

Úvod:
Vyšetření hladin volných lehkých řetězců (FLC-κ a FLC-λ) a nověji páru těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu (HLC-κ a HLC-λ) a jejich poměru (FLC-r a HLC-r) podstatně rozšířilo tradiční algoritmus vyšetření u mnohočetného myelomu (MM). Cílem studie bylo zhodnocení vztahu klasických prognostických ukazatelů MM, standardního poměru FLC-κ/λ a HLC-κ/λ (^sFLC-r a ^sHLC-r), modifikovaného poměru, tj. „involved/uninvolved“ FLC a HLC (^mFLC-r a ^mHLC-r ), rozdílu „involved – uninvolved“ FLC a HLC (FLC-dif. a HLC-dif.) k výsledkům stratifikačních modelů MM založených na výsledku cytogenetického vyšetření.

Soubor a metody:
V souboru 97 nemocných s MM byly metodou Freelite^TM vyšetřeny hladiny FLC a vypočteny indexy ^sFLC-r, ^mFLC-r a FLC-dif, metodou Hevylite^TM stanoveny hladiny HLC a vypočteny indexy ^sHLC-r, ^mHLC-r a HLC-dif. K cytogenetické analýze byla použita metoda fluorescenční in situ hybridizace FISH s imunofluorescenčním značením plazmocytů (FICTION, tj. Fluorescence Immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for the Investigation of Neoplasms), k stratifikaci MM jednak standardní stážovací systémy dle Durieho-Salmona (D-S) a International Staging System (ISS), jednak stratifikační modely založené na výsledcích cytogenetické analýzy, tj. „Mayo Stratification of Myeloma and Risk-Adapted Therapy“ (mSMART) a „Revised International Staging System“ (R-ISS).

Výsledky:
Stratifikace dle mSMART a R-ISS se vyznačuje ve srovnání se standardními stážovacími systémy dle D-S a ISS výrazně odlišným zastoupením nemocných „standard event. low risk“ (71, 15,5, 11,3 a 29,9 %), „intermediate risk“ (15,5, 53,6, 34 a 33 %) a „high risk“ (13,4, 30,9, 54,7 a 37,1 %). Stratifikace dle mSMART prokázala při rozboru vztahu k prognostickým faktorům MM (Hb, albumin, β₂-M, kreatinin a LDH) významný vztah pouze k β₂-M, R-ISS pouze k Hb a kreatininu. V případě stážování dle D-S byl prokázán významný vztah stadií 1–3 a podstadií A a B k hodnotám ^mFLC-r, FLC-dif. a ^mHLC-r, u ISS navíc i k HLC-dif. a koncentraci MIg. Při analýze výsledků stratifikace mSMART byl prioritně popsán významný vztah rizikových kategorií 1–3 k hodnotám indexů ^mFLC-r a ^sHLC-r a v případě R-ISS k indexu ^mHLC-r a koncentraci MIg. V obou cytogeneticky založených stratifikačních modelech byla zjištěna absence vztahu k indexům ^sFLC-r, FLC-dif. a HLC-dif.

Závěr:
Srovnání výsledků standardních stážovacích systémů dle D-S a ISS s cytogeneticky založenými modely mSMART a R-ISS prokázalo rozdílné zastoupení rizikových skupin, významně odlišný vztah ke klasickým prognostickým ukazatelům a originálně zjištěný vztah stratifikace mSMART k ^mFLC-r a ^sHLC-r a R-ISS k ^mHLC-r a koncentraci MIg.

Klíčová slova:
cytogenetická analýza – mnohočetný myelom – poměr páru těžkých/lehkých řetězců imunoglobulinu – poměr volných lehkých řetězců imunoglobulinu – prognostické faktory – stratifikace mnohočetného myelomu

Úvod

Mnohočetný myelom (MM), toto geneticky vysoce heterogenní onemocnění způsobené nekontrolovanou proliferací a akumulací neoplastických elementů plazmocelulární linie, je souborem genotypicky a klinicky různorodých forem onemocnění vyznačujících se širokým spektrem cytogenetických změn zastávajících určující roli v patobiologii, klinickém obraze, léčebné odezvě a prognóze nemoci [1–5]. Bezmála dvojnásobné prodloužení délky života v poslední dekádě je výsledkem významného posunu znalostí patogeneze nemoci a zavedení stále sofistikovanějších vyšetřovacích, stratifikačních a léčebných metod. Značná genetická různorodost MM vyznačující se vedle zmnožení chromozomů (hyperploidie) především přítomností prognosticky nepříznivých strukturálních aberací charakteru t(11;14)(q13;q32), t(4;14)(p16;q32), t(14;16)(q32;23), t(14;20)(q32;q12) a změnami typu del(13q14), del(17p13) a zmnožení oblasti 1q21 (nonhyperploidie) se projevuje snížením a zkrácením léčebné odezvy i celkového přežívání (OS) [2,3,6–11]. Vzhledem k tomu, že předchozí stážovací systémy dle Durieho-Salmona (D-S) a International Staging System (ISS) [9–11] nenalezly přes svůj nesporný prognostický význam reálné uplatnění při výběru optimální, individuálně uzpůsobené léčby [12], byly sestaveny nové stratifikační modely, založené na výsledcích cytogenetické analýzy FISH (fluorescenční in situ hybridizace), a to jako obohacení kritérií ISS [13–16], β₂-M [17] a R-ISS (Revised International Staging System), nebo čistě „cytogenetického modelu mSMART“ (Mayo Stratification of Myeloma and Risk-Adapted Therapy) [12,18,19].

Standardní techniky vyšetření bílkovinného spektra používané v diagnostice, sledování průběhu a hodnocení léčebné odezvy MM, tj. gelová (SPE) a imunofixační (IFE) elektroforéza, vyšetření normálních imunoglobulinů (Ig) s pomocí nefelometrie, stanovení hladin volných lehkých řetězců imunoglobulinu FLC-κ a FLC-λ, jejich poměru (FLC-r) a nově i FLC-diference (FLC-dif.) metodou Freelite^TM, byly aktuálně rozšířeny o separátní kvantitativní vyšetření hladin párů těžkých/lehkých řetězců Ig HLC-κ a HLC-λ včetně jejich poměru, tj. „involved/uninvolved“ HLC (HLC-r) a HLC-diference (HLC-dif.) metodou Hevylite^TM [20–26]. Na rozdíl od zavedeného indexu FLC-r se klinické uplatnění indexu HLC-r teprve upřesňuje a hledají se další potenciální indikace vedle prokázaného přínosu v diagnostice a monitoraci IgA a hyposekrečního typu MM, v predikci maligní transformace monoklonální gamapatie nejistého významu (MGUS), hodnocení hloubky léčebné odezvy, časné detekce nastupující progrese/relapsu nemoci a prognostické stratifikaci MM [20,24,27–29].

Vzhledem k tomu, že do nynějška neproběhla ucelená studie, jež by se věnovala rozboru vztahu stratifikačních modelů založených na výsledcích metody FISH k výsledkům Freelite^TM a Hevylite^TM analýzy, zaměřila se předložená studie na rozbor vztahu výsledků mSMART a R-ISS stratifikace k indexům vyjadřujícím poměr sekrece monoklonálních (MIg) vs polyklonálních imunoglobulinů (PIg) myelomovými a normálními plazmocyty, tj. k indexům FLC-r a HLC-r. Východiskem studie byla snaha o ověření hypotézy, že hodnoty indexů FLC-r a HLC-r jako nepřímé ukazatele vnitřních biologických vlastností myelomové tkáně by měly souviset s charakterem nalezených chromozomových změn. Důvodem studie byl i předpoklad, že nabyté poznatky přispějí k rozšíření mozaiky dosavadních znalostí patobiologie MM a případně naleznou uplatnění i v klinické praxi.

Soubor nemocných a metody

Studie vychází z analýzy 97členného souboru s IgG (73,2 %) a IgA typem MM (26,8 %) vyšetřeného při diagnóze nemoci, splňujícího diagnostická kritéria International Myeloma Working Group (IMWG), tab. 1 [9,10]. Cytogenetická analýza byla provedena pomocí metody fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s imunofluorescenčním značením plazmatických buněk (FICTION, tj. Fluorescence Immunophenotyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for the Investigation of Neoplasms). Buněčná suspenze kostní dřeně zpracovaná pro klasické cytogenetické vyšetření z 24hodinové kultivace bez stimulace a fixována v metanol : octové kyselině (3 : 1), je převedena do fixace s 96% etanolem. Etanolem fixovaná suspenze byla nakapána na skla, obarvena s pomocí protilátky proti lehkým řetězcům MIg (anti-human κ nebo λ chain) konjugované s 7-amino-4-metalkumarin-3-octovou kyselinou (AMCA) (Vector Laboratories Burlingame, CA). Fluorescenční signál byl zesílen protilátkou (anti-goat) konjugovanou s AMCA (Vector Laboratories Burlingame, CA) pro snadnější identifikaci populace klonálních plazmatických buněk [30]. Pro metodu FICTION byl použit panel komerčně dodávaných sond pro určení delece a zmnožení v oblasti 1p32/1q21, delece 13q14, delece 17p13 (TP53), přestavby genu IgH (sondy XL IGH Plus, LSI IGH/CCND1 Dual Color Dual fusion, IGH/FGFR3 Dual Color Dual Fusion, LSI IGH/MAF Dual Color Dual Fusion, XL t(6;14), XL t(14;16)IGH/MAF) (Abbott Molecular, Des Plaines, IL, USA; Dako, Glostrup, Denmark; Kreatech, Amsterdam, The Netherlands; MetaSystems, Altlusheim, Germany). K určení nejčastějších početních změn chromozomů byly použity centromerické sondy pro chromozomy 15 a 17. Hybridizace byla provedena podle návodu výrobce sondy. Výsledek hybridizace byl hodnocen pomocí fluorescenčního mikroskopu a programu ISIS (MetaSystems). Hodnoceno bylo 100 plazmatických buněk; hodnota cut-off pro genové sondy byla 10 %, pro centromerické 20 %. K analýze proteinů séra byla použita séra zmražená na -78 °C deponovaná v biobance Oddělení klinické biochemie (OKB) a Hematologicko-onkologické kliniky (HOK) FN Olomouc, koncentrace MIg byla vyšetřena SPE přístrojem Sebia Hydrasy s pomocí skeneru Epson 1680, IFE soupravou Hydragel 4 IF. Hladiny FLC byly vyšetřeny soupravami Freelite SPA Plus κ free (rozmezí 3,3–19,4 mg/l) a Freelite SPA Plus λ free (5,7–26,3 mg/l) s výpočtem indexu FLC-r, tj. poměru FLC-κ/FLC-λ (0,6–1,65) [20,24]. Koncentrace HLC v séru byla vyšetřena turbidimetrem SPA Plus (The Binding Site) soupravami Hevylite Human: IgG-κ (3,84–12,07 g/l), IgG-λ (1,91–6,74 g/l), index IgG HLC-r z poměru IgG-κ /IgG-λ (1,12–3,21); hodnoty IgA-κ (0,57–2,08 g/l), IgA-λ (0,44–2,04 g/l), index IgA HLC-r z poměru IgA-κ/IgA-λ (0,78–1,94) [20,24]. Na rozdíl od standardních kritérií, založených stabilně na výpočtu indexů FLC-r (^sFLC-r) a HLC-r (^sHLC-r) z poměru FLC-κ/FLC-λ resp. HLC-κ/HLC-λ, vedoucích u nemocných s lehkým řetězcem (LŘ) λ k získání nízkých a prakticky obtížně interpretovatelných hodnot, byl použit pro výpočet „modifikovaných“ indexů FLC-r a HLC-r vždy poměr i-FLC/u-FLC (^mFLC-r) a i-HLC/u-HLC (^mHLC-r), tj. hodnota „involved“ typu použitá v čitateli zlomku (např. v případě i-HLC-λ poměr i-HLC-λ/u-HLC-κ). Jde o analogii principu, použitého v případě FLC-r v některých předchozích studiích [31–33], zejména ale v recentních revidovaných IMWG diagnostických kritériích MM (biomarker malignity FLC-r = i-FLC/u-FLC ≥ 100) [34]. Hodnoty β₂-mikroglobulinu (β₂-M) byly vyšetřeny metodou ELISA (< 2,3 mg/l), hodnoty Hb, trombocytů, albuminu, kreatininu a LDH (< 3,55 μkat/l) standardními postupy. K stratifikaci MM byly použity vedle standardních stážovacích systémů dle Durieho-Salmona (D-S) a International Staging System (ISS) [9–11] i recentní stratifikační modely mSMART a R-ISS (tab. 2) [12,19]. Zařazení do studie bylo vázáno na podpis informovaného souhlasu, design studie byl schválen etickou komisí FN Olomouc.

Získaná data byla analyzována pomocí statistického software IBM SPSS Statistics 22, normalita dat byla posouzena s pomocí Shapirova-Wilkova testu. Ke statistické analýze byly použity Pearsonův test, Spearmanova korelační analýza, test dle Kruskala-Wallise, U-test dle Manna-Whitneye, případně Fischerův přesný test s Bonferroniho korekcí signifikance. Všechny testy byly prováděny na hladině významnosti p < 0,05.

Výsledky

Výsledky vyšetření základních klinicko-laboratorních charakteristik v souboru 97 nemocných vyšetřených při diagnóze MM jsou shrnuty v tab. 1. Abnormální karyotyp byl zjištěn v 90,7 %, komplexní změny v 64,9 %, del(13q14) v 50,5 %, přestavby genu IgH (těžký řetězec imunoglobulinu) se vyskytovaly v 36,1 %, z toho t(11;14) v 11,3 %, t(4;14) v 17,5 % a t(14;16) v 3,1 %, aberace typu zmnožení oblasti 1q21 v 46,4 % a del(17p13) (TP53) v 8,2 %.

Výsledky stratifikace

Výsledky stratifikace do 3 klinických stadií (stadium 1–3) s pomocí „referenčních“ standardních stážovacích systémů podle D-S a ISS a 2 analyzovaných stratifikačních modelů mSMART a R-ISS, třídících nemocné podle průkazu prognosticky odlišně závažných chromozomových změn do 3 rizikových skupin, tj. „low, resp. standard risk“ (kategorie 1), „intermediate“ (kategorie 2) a „high risk“ (kategorie 3) jsou shrnuty v tab. 2. V rámci usnadnění komparace všech 4 stratifikačních systémů byla ve mSMART stratifikaci provedena v originálním schématu výměna označení rizikových skupin, tj. nemocní „standard risk“ byli označeni jako kategorie 1 a „high risk“ kategorie 3. S výjimkou ISS bylo zastoupení vyčleněných stadií, resp. rizikových skupin u zbývajících 3 stratifikačních systémů nápadně rozdílné: stážování dle D-S se vyznačovalo bezmála 5krát častějším výskytem stadia 3 (velká nádorová masa) nežli stadia 1 (malá nádorová masa), stratifikace mSMART upřednostňovala značně asymetricky, tj. 4,5krát častěji rizikovou skupinu „standard risk“ (kategorie 1) oproti „intermediate“ (kategorie 2) a > 5krát častěji nežli rizikovou skupinu „high risk“ (kategorie 3). Aplikace recentní stratifikace R-ISS vedla k dominanci kategorie 2 na úkor kategorie 3 a zejména kategorie 1 (tab. 3).

McNemarův-Bowkerův test symetrie popsal shodu klasifikace dle ISS a mSMART v 29,9 %, přičemž klasifikace dle mSMART byla s ohledem na škálu 1–3 nižší v 52,5 %, zatímco ISS pouze v 17,6 %, posun v klasifikaci byl vysoce signifikantní (p = 0,0003). Srovnání ISS vs R-ISS systému prokázalo shodu v 59,8 %, přičemž stratifikace dle R-ISS byla ve vyšší skupině v 21,6 % a ISS stratifikace v 18,6 %, posun v klasifikaci byl významný (p = 0,001). Porovnání klasifikace mSMART vs R-ISS odhalilo shodu v 40,2 %, vyšší klasifikace dle R-ISS byla v 48,5 %, dle mSMART pouze v 11,3 %, posun v klasifikaci byl vysoce signifikantní (p < 0,0001).

Vztah výsledků stratifikace k přítomnosti chromozomových změn

Analýza vztahu 9 vyhodnocených cytogenetických ukazatelů s pomocí iFISH, tj. del(13q14)(Rb1), t(11;14), t(4;14), t(14;16), trizomie chromozomů 15 a 17, zmnožení 1q21, delece 17p13 a přítomnosti komplexních změn neshledala statisticky významnou závislost na stadiích 1–3 vyhodnocených s pomocí stážovacího systému D-S, v případě ISS byl zaznamenán pouze častější výskyt del(13q14) ve stadiu 3 nežli 2. Při analýze systému mSMART bylo po vyloučení chromozomálních aberací patřících mezi vlastní stážovací kritéria zjištěno významně častější zmnožení 1q21 ve skupině „intermediate“ vs „standard risk“ a významně vyšší výskyt komplexních změn ve skupině „high risk“ nežli „standard“ a „intermediate risk“.

Analýza vztahu vybraných prognostických faktorů MM k výsledkům stratifikace

Srovnání vybraných standardních prognostických faktorů (PF) s výsledky stážování dle D-S a ISS nebylo provedeno, neboť jde vesměs o kritéria těchto stážovacích systémů. Analýza vztahu PF k výsledkům stratifikace dle mSMART prokázala pouze v případě β₂-M významně vyšší hodnoty v rizikové kategorii „high risk“ (kategorie 3) vs „standard risk“ (kategorie 1), nikoliv v případě Hb, trombocytů (Thr), albuminu, kreatininu a LDH, i když jejich hodnoty vesměs odpovídaly zařazení do jednotlivých rizikových skupin (tab. 4). V případě stratifikace dle R-ISS byly s výjimkou Thr hodnoty mediánů všech ostatních 5 analyzovaných PF statisticky vysoce odlišné a to u albuminu, β₂-M a kreatininu mezi kategoriemi 1 vs 3 („low vs high risk“, graf 1A), v případě LDH i mezi stadii 1 vs 2, avšak u Hb pouze mezi stadii 2 vs 3 (tab. 4, graf 1B).

Korelace výsledků SPE, Freelite^TM a Hevylite^TM s výsledky stážování dle D-S a ISS

V rámci „referenční analýzy“ v případě klasického, dnes již prakticky opouštěného systému dle D-S byl zjištěn statisticky významný vztah stadií 1–3 pouze k hodnotám modifikovaného indexu ^mFLC-r (graf 1C) a FLC-dif. (graf 1D), nikoliv k standardnímu indexu ^sFLC-r, v případě indexu HLC-r byla zjištěna statistická významnost pouze k modifikovanému indexu ^mHLC-r , nikoliv k ^sHLC-r a HLC-dif. (tab. 5). V případě MIg bylo v souladu s funkcí D-S stážovacího kritéria zřejmé významné narůstání hodnot mediánu M-proteinu s pokročilostí MM. Při analýze podstadií A vs B dle D-S byla potvrzena významná statistická rozdílnost nápadně odlišných hodnot mediánů ^mFLC-r, FLC-dif. (graf 2A) a ^mHLC-r. V případě ISS byl zaznamenán vysoce významný vztah hodnot ^mFLC-r, FLC-dif. a koncentrace MIg, ale i ^mHLC-r (graf 2B) a HLC-dif. v séru ke stadiím 1–3 provázený narůstající výší hodnot mediánů signifikantně odlišných ukazatelů (tab. 5).

Korelace výsledků SPE, Freelite^TM a Hevylite^TM s výsledky stratifikace dle mSMART a R-ISS

V systému mSMART byly prokázány významně vyšší hodnoty pouze v případě indexu ^mFLC-r v rizikové skupině „high risk“ (kategorie 3) vs „standard risk“ (kategorie 1) a ^sHLC-r v rizikové skupině „intermediate“ (kategorie 2) vs skupiny „standard risk“ (kategorie 1). Jak patrno, v případě ^sFLC-r, ^sHLC-r, ^mHLC-r a HLC-dif. byly nejvyšší hodnoty mediánů v kategorii 2, tj. „intermediate risk“ (tab. 6). V případě stratifikace dle R-ISS byly přítomny významně vyšší hodnoty pouze indexu ^mHLC-r v kategorii 3 vs kategorii 1 (graf 2C) a významně vyšší koncentrace MIg v rizikové kategorii 2 i 3 nežli v kategorii 1 (tab. 6, graf 2D).

Diskuse

MM je plazmocelulární neoplazie s komplexní, neúplně vyřešenou molekulární patogenezou, složitou subklonální strukturou a intraklonální různorodostí, s významnou klinicko-laboratorní, genetickou a molekulárně-biologickou různorodostí [6,7]. Mnoho recentních studií se snaží s použitím molekulárně-biologických metod o odhalení vlastní biologické podstaty nemoci [35,36]. Zavedení FISH do klinické praxe vedlo nejen k hlubšímu pochopení podstaty nemoci, ale stalo se i oporou praktického přístupu k jejímu vedení, neboť přispívá k odlišení nemocných s indolentní formou MM s nízkým sklonem k relapsu od forem s časným progresivním průběhem [8,12,15,37]. Zavedení iFISH do klinické praxe vedlo k sestavení nových stratifikačních systémů, např. mSMART, jež zaznamenala od roku 2007 již 3. revizi [12,18,39], a recentně i „hybridního“ systému R-ISS založeného na kombinaci ISS a prognosticky rizikových chromozomových abnormalit [19]. Obě stratifikace s robustním prognostickým potenciálem jsou považovány za východisko výběru individuální, již od počátku intenzivní kombinované terapie u „high risk“ a méně toxické terapie u „low risk“ forem MM, výběrově i indikace transplantační, konsolidační nebo udržovací terapie [12,18,19].

Výskyt chromozomových aberací začleněných do stratifikačních modelů dle mSMART a R-ISS byl v našem souboru až na lehce nižší výskyt t(11;14), tj. 11,3 % vs 21 % a 18,3 %, vyšší výskyt t(4;14), tj. 17,5 % vs 14 % a 10 %) podobný s výsledky předchozích studií [2,8].

Srovnání výsledků jednotlivých stratifikačních systémů

Rozdělení nemocných pomocí standardních stážovacích systémů (D-S a ISS) a nově zkoncipovaných stratifikačních modelů (mSMART a R-ISS) vyznělo značně rozdílně. Pouze ISS systém vedl k proporcionálnímu rozdělení nemocných do 3 stadií, zatímco v D-S systému byla patrna 5krát častější preference stadia 3 než stadia 1. Systém mSMART začlenil většinu nemocných (71 %) do kategorie „standard risk“, tj. 4,5krát častěji než do „intermediate risk“ a > 5krát častěji nežli do kategorie „high risk“, zatímco v R-ISS dominovali nemocní „intermediate risk“ na úkor kategorie „high risk“ a zejména „low risk“ (tab. 4). Při srovnání s výsledky Mayo kliniky byli v našem souboru častěji zastoupeni nemocní „standard risk“ (60 % vs 71,1 %), a to na úkor nemocných „intemediate risk“ (20 % vs 15,5 %) a „high risk“ (20 % vs 13,4 %) [12]. Taktéž výsledky IMWG stratifikace dle R-ISS se od našeho souboru poněkud lišily: stadium 1 „low risk“ 28 % vs 15,5 %, stadium 2 „intermediate risk“ 62 % vs 53,6 % a stadium 3 „high risk“ 10 % vs 30,9 % [19]. S pomocí Mc Nemarova-Bowkerova testu symetrie byl zaznamenán při srovnání systémů dle ISS vs mSMART vs. R-ISS významný posun: v případě mSMART vs ISS posun do kategorie mSMART „standard risk“ u 1/2 nemocných, v případě ISS vs R-ISS do R-ISS „high risk“ u 1/5 nemocných a při srovnání mSMART vs R-ISS posun do R-ISS „high risk“ kategorie u bezmála 1/2 nemocných. Vzájemná shoda mezi stadii ISS vs mSMART byla u 1/3, mezi ISS vs R-ISS u 2/3 a mezi mSMART a R-ISS u 40 % nemocných. Z uvedeného vyplývá, že specifická, značně odlišná stratifikační kritéria přinesla významně odlišný pohled na třídění nemocných do dílčích, prognosticky odlišných stadií, případně rizikových skupin. Praktická použitelnost všech 4 stratifikačních systémů byla dobrá. Je ale nasnadě, že doporučení nejvhodnějšího stratifikačního postupu v klinické praxi vyplyne z výsledků připravované prognostické analýzy, věnované vztahu k PFS („progression free survival”) a OS.

Vztah výsledků stratifikace k přítomnosti chromozomových změn

Naše zjištění, že standardní stratifikační systémy jen velmi omezeně korelují s přítomností chromozomálních změn, odpovídá i zkušenostem předchozích studií [39–41]. Ačkoliv v naší analýze nebyl zaznamenán významný vztah stratifikace dle D-S k žádné z 9 vyšetřených chromozomových změn, byl popsán častější výskyt del(13q14) ve stadiu 3 [41] a narůstající výskyt nemocných s abnormálním karyotypem s pokročilostí stadia MM [42]. Při analýze systému dle ISS jsme zaznamenali na rozdíl od předchozích zpráv pouze častější výskyt del(13q14) ve stadiu 3 vs 2. V případě zmnožení 1q21 bylo na rozdíl od našich výsledků popsáno významně vyšší zastoupení ISS stadia 3 vs stadia 1 [39,40], prognostický význam platil ale pouze v případě β₂-M < 5,5 mg/l, tj. ve stadiu 1 a 2 [40]. V případě stratifikace mSMART byl vyjma rekurentních chromozomových aberací prokázán významně častější výskyt zmnožení 1q21 nemocných s „intermediate“ vs „standard risk“ a komplexních změn nemocných „high risk“ vs „standard“ a „intermediate risk“. Zřejmě průkaz evidentně vyššího prognostického potenciálu „high risk“ chromozomových aberací ve srovnání se standardními stážovacími systémy [2] byl v rámci IMWG impulzem k sestavení R-ISS [19].

Vztah výsledků stratifikace k prognostickým faktorům MM

Korelační analýza mezi vybranými biochemickými PF MM a výsledky stratifikace dle mSMART prokázala ve skupině „high risk“ oproti „standard risk“ významně vyšší hodnoty pouze β₂-M, nikoliv ostatních analyzovaných PF, což dokládá nezávislost Hb, albuminu, kreatininu a LDH na přítomnosti „vysoce rizikových“ chromozomových změn. Chybějící vztah albuminu a LDH k chromozomovým aberacím potvrzuje účelnost při zařazení obou parametrů mezi kritéria „hybridního“ R-ISS, zahrnujícího vedle nepříznivých cytogenetických markerů navíc ukazatele se vztahem k rozsahu nádorové masy, poruše renální funkce (β₂-M), účinku zánětlivých cytokinů v mikroprostředí KD (albumin) i vysokému proliferačnímu náboji a agresivitě myelomové tkáně (LDH) [43], a tím i lepšímu třídění nemocných s MM do homogenních, prognosticky odlišných rizikových skupin [19]. Z „klasických“ PF nezahrnutých mezi kritéria R-ISS (albumin, β₂-M a LDH) byl zaznamenán významně odlišný vztah k rizikovým skupinám R-ISS pouze v případě Hb a kreatininu [43].

Analýza vztahu výsledků SPE, Freelite^TM a Hevylite^TM k výsledkům stážování dle D-S a ISS

V rámci „referenční analýzy“ klasického, dnes již stále méně používaného systému dle D-S byl zjištěn významný vztah stadií 1–3 a podstadií A a B pouze k hodnotám modifikovaného indexu ^mFLC-r a FLC-dif., potvrzující závislost vztahu obou FLC indexů na rozsahu myelomové tkáně a alteraci renální funkce [12,20,24]. V souboru Mayo kliniky se 27 % nemocných s vysokou hodnotou FLC manifestovalo akutní renální insuficiencí (ARI), jde tedy o biomarker renálního rizika [33]. V případě indexu ^mHLC-r (nikoliv ^sHLC-r a HLC-dif.) byla zjištěna významná závislost na pokročilosti MM dle D-S, potvrzující kauzální závislost poměru i-HLC/u-HLC na velikosti nádorové masy, tj. nepřímo na množství myelomových buněk a indukované supresi normálních plazmocytů. V případě MIg byl potvrzen očekávaný narůst M-proteinu s pokročilostí MM, zato chybějící rozdílnost mezi podstadii A vs B lze vysvětlit na rozdíl od FLC nezávislostí výše MIg s kompletní molekulou na stavu renální funkce. V případě ISS byl originálně zjištěn vysoce významný vztah hodnot ^mFLC-r, FLC-dif. a koncentrace MIg, méně nápadně i ^mHLC-r a HLC-dif. v séru ke stadiím 1–3, podložený narůstající hodnotou mediánů nasvědčující, že i přes svou jednoduchost se ISS vyznačuje významným vztahem k rozsahu a biologickým vlastnostem nádorové tkáně. Naše zjištění je v souladu s již dříve popsaným významným vztahem mezi vysokými hodnotami HLC-r, β₂-M a tíží myelomové infiltrace KD [44]. Významné postavení indexu HLC-r v biologii a klinické manifestaci MM vyplývá i ze 2 studií, které pomocí multivariační analýzy prokázaly, že stážovací systém založený na patologických hodnotách HLC-r (< 0,01 nebo > 200, resp. < 0,022 nebo > 45) a β₂-M měl vyšší prognostický potenciál nežli stratifikace dle ISS [45–47].

Analýza vztahu výsledků SPE, Freelite^TM a Hevylite^TM k výsledkům stratifikace podle mSMART a R-ISS

Statistická analýza věnovaná srovnání výsledků SPE, Freelite^TM a Hevylite^TM k výsledkům stratifikace podle mSMART prokázala významně vyšší hodnoty indexu ^mFLC-r u nemocných „high“ vs „standard risk“ a vyšší hodnoty ^sHLC-r u nemocných „intermediate“ vs „standard risk“. Z toho vyplývá, že přítomnost prognosticky významných chromozomových změn předurčuje průběh procesů uplatňujících se v produkci, funkčním uplatnění a katabolizmu „involved“ a uninvolved“ FLC a HLC. Uvedené zjištění podporuje existence prokázaného vztahu vysokých hodnot FLC k renální insuficienci a krátkému OS v případě přítomnosti t(14;16), tedy jednoho z kritérií „high risk“ MM podle mSMART [6,8,48]. V dosavadní literatuře jsme stejně zkoncipovanou analýzu a námi podchycený vztah ^mFLC-r a ^sHLC-r k výsledkům mSMART stratifikace nezaznamenali. Ve studii věnované stratifikaci dle D-S byly zjištěny hraničně nižší hodnoty indexu FLC-r ve stadiích 1 + 2 vs 3, nikoliv mezi stadii 1 vs 2 + 3, v případě ISS vyzněl vztah FLC-r k výsledkům stážování taktéž významně [49]. Je uváděno, že hodnoty „involved/uninvolved“ FLC-r (^mFLC-r) ≥ 100 a hodnota „involved“ FLC > 100 mg/l jsou znakem „high risk“ doutnající/asymptomatické formy MM se 72%, případně 64–100% rizikem progrese do symptomatické fáze v průběhu 2 let [33,50,51]. ^mFLC-r ≥ 100 je jedním ze 3 biomarkerů malignity, tj. MDE („myeloma defining events”), patřící k novým diagnostickým kritériím MM, a mezi ukazatele progrese, řadící nemocné mezi kandidáty časné terapeutické intervence [33,34,52]. Přínos vyšetřování párů HLC pro biologii MGUS a MM dokládají zjištění Katzmanna, jenž v souboru 999 jedinců s MGUS s izotypem IgG prokázal, že specifická suprese IgG-λ predikuje s mnohaletým předstihem vývin maligní transformace [28]. Přínos vyšetření hladin HLC u MM metodou Hevylite^TM vyplývá i z průkazu prognostického významu u asymptomatické formy MM [53] i z průkazu významného vztahu rizikových stadií MGUS ke stupni suprese „uninvolved“ HLC [54]. Analýza stratifikace dle R-ISS vyzněla poněkud odlišně, neboť byly zjištěny významně vyšší hodnoty indexu ^mHLC-r ve stadiích „high“ a „intermediate risk“ vs „low risk“ a vyšší koncentrace MIg v „intermediate“ vs „high risk“ MM. Z uvedeného vyplývá, že podstatná odlišnost stratifikačních kritérií mSMART, zohledňující pouze výsledky iFISH a „hybridního“ modelu R-ISS opírající se navíc o standardní PF (albumin, β₂-M a LDH) vede i k odlišnému vztahu k ukazatelům, odrážejícím doposud jen neúplně probádanou patogenezu MM. Z průkazu signifikantního vztahu indexů ^mFLC-r a ^sHLC-r k mSMART a ^mHLC-r k modelu R-ISS vyplývá, že nejde o nezávislé, a proto ani o vhodné parametry, jež by mohly dále navýšit prognostický potenciál obou cytogeneticky založených stratifikačních systémů. Složitost problematiky umocňuje zjištění Bradwella [45], který na podkladě analýzy PFS vyvodil, že cytogenetické aberace, z nichž t(4;14) a del(17p) patří mezi kritéria mSMART a R-ISS stratifikačních modelů prokázaly v multivariační analýze nižší prognostický význam nežli HLC-r [45]. Budoucí snaha o nalezení citlivějších prognostických markerů MM se bude nejspíše ubírat cestou nalezení vysoce prognosticky potentních rizikových ukazatelů odhalených s pomocí genové expresní analýzy, vyšetření polymorfizmu nukleotidů a dalších ještě náročnějších mole­kulárně-biologických metod [55,56].

Závěr

Studie potvrdila, že nové stratifikační modely mSMART a R-ISS, založené na výsledcích iFISH, vedou při srovnání se standardními systémy dle D-S a ISS k výrazně odlišnému rozvrstvení nemocných do rizikových skupin, což vysvětlil prakticky chybějící vztah stážování dle D-S a s výjimkou del(13q14) i ISS ke kterékoliv z 9 vyšetřených, prognosticky významných chromozomových aberací u MM. Další příčinou byl izolovaný vztah stratifikace dle mSMART pouze k hodnotám β₂-M a „hybridního“ R-ISS k Hb a kreatininu s absencí významného vztahu k některému z ostatních vyšetřených PF (albumin a LDH). V případě stážování podle D-S byl zaznamenán významný vztah stadií 1–3 a rozdíl podstadií A vs B k hodnotám ^mFLC-r, FLC-dif. a ^mHLC-r, v případě ISS navíc i k HLC-dif. a koncentraci MIg. Analýza výsledků stratifikace podle mSMART modelu dospěla k originálnímu odhalení významného vztahu rizikových skupin k hodnotám ^mFLC-r a ^sHLC-r, zatímco u R-ISS pouze k ^mHLC-r a koncentraci MIg. Byla ověřena praktická použitelnost stratifikace mSMART a R-ISS s tím, že o výběru nejvhodnějšího modelu pro klinickou praxi rozhodne výsledek budoucí prognostické analýzy věnované PFS („progression free survival“) a OS. Z uvedených výsledků vyplývá, že určení genetických změn je v rutinní klinické praxi zatím nenahraditelné, neboť stratifikuje pacienty do genetických prognostických podskupin, které nejvíce odrážejí heterogenitu klinického průběhu onemocnění a prognózu nemocných s MM.

Dosažené výsledky demonstrují odlišný vztah analyzovaných stratifikací k standardním PF MM, zejména ale originální přínos vyšetření poměru „involved/uninvolved“ forem FLC a HLC, tj. indexů ^mFLC-r a ^mHLC-r a jejich rozdílu (FLC-dif. a HLC-dif.) k hlubšímu pochopení doposud neúplně probádané patobiologie MM.

Podpora grantové studie IGA MZ ČR NT /12451–5 a NT/14400–3.

prof. MUDr. Vlastimil Ščudla, CSc.

vlastimil.scudla@fnol.cz

III. interní klinika – nefrologie, revmatologie a endokrinologie LF UP a FN Olomouc

www.fnol.cz

Doručeno do redakce 29. 12. 2015

Přijato po recenzi 27. 1. 2016