Možnosti stanovení minimální zbytkové choroby pomocí RQ-PCR u B-CLL pacientů

Stanovení přítomnosti minimální zbytkové choroby (MRD) poskytuje zásadní informaci o léčebné odpovědi u hematologických malignit obecně. Terapeutickým cílem je dosažení MRD negativní remise onemocnění, proto probíhá vývoj dostatečně citlivých metod detekce minimální zbytkové choroby na molekulární úrovni.

Jedním z přístupů detekce MRD u pacientů s chronickou lymfatickou leukémií je využití fluorescenčního barviva SYBR Greenu, specifita reakce je zajištěna navržením pacient specifických oligonukleotidů, jeden primer vždy lokalizován do CDR3 oblasti expandovaného klonu. Použití SYBR Greenu neodstraňuje problémy s nespecifickou amplifikací, detekována je každá dvouřetězcová DNA a dochází k falešnému zvýšení měřené fluorescence.

V současnosti je detekce minimální zbytkové choroby založena na využití dvou J_H- genově specifických TaqMan sond (J_HQ1/4/5, J_HQ6). Vzhledem k tomu, že hypermutační proces ovlivňuje kromě V_H segmentů i J_H segmenty a TaqMan sondy jsou specifické pouze pro J_H, mohou být kromě omezení specifity detekovány i další přestavby IgV_H, které využívají stejný J_H segment. Pro klonální přestavby IgV_H s J_H2 segmentem nelze uvedený metodický přístup použít. Specifita tohoto typu RQ-PCR je významně ovlivněna optimálním návrhem ASO oligonukleotidu a optimalizací reakčních teplot.

Nový citlivější přístup ke stanovení minimální zbytkové choroby u B-CLL pacientů využívá LNA (Locked Nucleic Acid) sondy TaqMan technologie. U každého pacienta byly navrženy specifické oligonukleotidy, jeden vždy lokalizován do CDR3 oblasti expandovaného klonu a pro kvantifikaci připraven plazmid s naklonovanou pacient specifickou IgV_H sekvencí. Jako referenční gen jsme zvolili gen pro albumin. Pro jednotlivé V_H rodiny byly navrženy do FR3 oblasti univerzální LNA modifikované TaqMan sondy, specifické pro všechny klony dané V_H rodiny. Alogenní transplantaci podstoupili pouze pacienti s nemutovaným IgV_H, MRD jsme tedy sledovali u této skupiny. V případě pacientů s hypermutovaným IgV_H, kde není možné použít navrženou V_H specifickou LNA sondu, lze pro sledování navrhnout pacient specifickou LNA sondu.

Ve srovnání s flow cytometrií, dosahuje stanovení MRD pomocí ASO RQ-PCR o řád vyšší senzitivity tj. 10^-5. LNA modifikované sondy a ASO RQ-PCR představují dostatečně specifický a senzitivní přístup ke stanovení minimální zbytkové choroby u B-CLL pacientů.