Analýza mikroRNA u epiteliálního karcinomu vaječníku

Souhrn

Východiska:
Karcinom vaječníku je nádorové onemocnění s vysokou mortalitou, které bývá diagnostikováno v pozdních stadiích, což potvrzuje nutnost identifikace nových neinvazivních biomarkerů umožňujících detekci onemocnění v raném stadiu. Jednou z potenciálních možností se ukazují být mikroRNA (miRNA). MiRNA jsou malé nekódující molekuly RNA regulující genovou expresi a podílející se na mnohých buněčných procesech vč. karcinogeneze.

Soubor pacientů a metody:
Celková RNA byla izolována ze sér devíti žen s diagnostikovaným karcinomem vaječníku, které byly léčeny na Masarykově onkologickém ústavu. Jako kontrolní vzorky sloužila séra šesti žen bez prokazatelného onkologického onemocnění. Získaná RNA byla pomocí reverzní transkriptázy přepsána do cDNA, která byla podrobena preamplifikaci. Exprese miRNA byla stanovena pomocí TaqMan MikroRNA testů. Ke statistické analýze byl použit neparametrický Mann-Whitneyův U test.

Výsledky:
Hladiny miRNA miR-30a-5p a miR-26b byly identifikovány jako statisticky významně zvýšené v séru pacientek s karcinomem vaječníku. Další miRNA vykazující zřetelně zvýšenou hladinu byly miR-628-5p, 520c-3p, miR-486 a let-7b. Naopak miR-596 vykazovala výrazně sníženou hladinu v séru pacientek s karcinomem vaječníku.

Závěr:
Byla prokázána signifikantně odlišná exprese nejméně dvou miRNA (miR-30a-5p a miR-26b) v sérech pacientek s karcinomem vaječníku v porovnání se séry odebranými od zdravých žen. Tyto miRNA by mohly být v budoucnu využity jako účinný diagnostický nástroj k detekci přítomnosti karcinomu vaječníku právě v rámci odběru tzv. tekutých biopsií.

Klíčová slova:
mikroRNA – biomarkery – epiteliální karcinom vaječníku – qPCR

Úvod

Rakovina vaječníku je gynekologickou malignitou, která se řadí mezi jednu z nejčastějších příčin úmrtí mezi ženami na celém světě. V ČR vykazuje epiteliální ovariální karcinom v rámci gynekologických zhoubných nádorů nejvyšší mortalitu. Navzdory nemalému pokroku v chirurgických technikách a terapeutických strategiích mají pacientky s diagnostikovanými nádory vaječníku stále nepříznivou prognózou s výrazně nižším 5letým přežitím v porovnání s jinými nádorovými onemocněními [1]. Vysoká mortalita je spojená především s nedostatečnými diagnostickými markery umožňujícími včasnou diagnostiku v raných asymptomatických stadiích onemocnění. Nemoc je tudíž diagnostikována v pozdějších fázích, kdy již mají pacientky objektivní potíže, což je spojeno se zhoršenou prognózou onemocnění a mnohem obtížnější léčbou.

MikroRNA (miRNA) jsou malé, 18–25 nukleotidů dlouhé nekódující RNA, které regulují mRNA na posttranskripční úrovni. Obvykle se váží na 3’UTR úsek cílově mRNA, čímž obvykle dochází buď k degradaci cílové mRNA nebo k inhibici iniciace translace [2–4]. Neustále narůstající množství dat monitorujících expresi miRNA potvrzuje jejich nezastupitelnou úlohu v různých biologických procesech jako je buněčný růst, proliferace, diferenciace, migrace a invazivita nádorových buněk [5]. Proto možnosti klinického využití miRNA představují značně atraktivní oblast výzkumu v celosvětovém měřítku.

V této studii byly analyzovány hladiny miRNA v sérech pacientek, u kterých byl diagnostikován epiteliální karcinom vaječníku. Na základě komparativní analýzy s hladinami miRNA v sérech pocházejících od žen bez prokázané onkologické diagnózy byly vybrány miRNA, které by mohly v budoucnu nalézt uplatnění právě při diagnostice epiteliálního karcinomu vaječníku.

Materiál a metody

Pacientky a vzorky

Vzorky sér byly získané od pacientek, které byly léčeny v Masarykově onkologickém ústavu (MOÚ) z důvodu diagnostikovaného epiteliálního karcinomu vaječníku v letech 2006–2010 (tab. 1). Ze stejného období také pochází i kontrolní vzorky, které byly získány v rámci krevních odběrů při preventivných kontrolách zaměstnankyň, které jsou v MOÚ periodicky prováděny. Projekt byl schválen Etickou komisí MOÚ v Brně. Podepsaný informovaný souhlas byl získán od všech žen, jejichž vzorky sér byly zařazeny do studie.

Izolace miRNA a její kvantifikace

MiRNA byla izolována z krevního séra pomocí TaqMAN miRNA ABC Purification kitu dle instrukcí výrobce (Applied Biosystems). Po purifikaci miRNA byla stanovena její čistota a koncentrace, poté následoval přepis do cDNA pomocí kitu TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit a následovala preamplifikace pomocí Taq-Man PreAmp Master Mix. Kvantitativná PCR v reálním čase byla provedena na ABI Prism 7900 systému s využitím mikrofluidních karet Human miRNA Arrays. Komparativní analýza exprese miRNA pocházející ze sér pacientek s karcinomem vaječníku v porovnání se zdravými kontrolami byla provedena pomocí neparametrického Mann-Whitneyova U testu.

Výsledky a diskuze

Byla stanovena exprese miRNA v sérech devíti pacientek s diagnostikovaným karcinomem vaječníku. Získané hodnoty hladin miRNA byly normalizované vůči hsa-miR-550 sloužící jako referenční gen.

Statisticky významnou vyšší hladinu ve vzorcích séra s diagnostikovaným karcinomem vaječníku vykazovaly miR-30a-5p a miR-26b (obr. 1). Spolu s těmito dvěma miRNA byla dále pozorována zvýšená exprese miR-628-5p, miR-520c-3p, miR-486, miR-16, let-7b a miR-132 u pacientek s karcinomem vaječníku ve srovnání se zdravými kontrolami, avšak statisticky nevýznamně. Tyto miRNA lze kromě let-7b obecně označit jako onkogenní. Naopak miR-596, která byla výrazně snížena ve vzorcích sér pocházejících od pacientek s karcinomem vaječníku v porovnání se zdravými kontrolami, patří mezi miRNA s tumor supresorovými vlastnostmi. Tato její funkce již byla prokázána u karcinomu ústní dutiny [6], avšak doposud nebyla prokázána souvislost mezi změněnou expresí miR-596 a karcinomem vaječníku.

Celosvětově vůbec první analýza zaměřená na stanovení hladin miRNA ve vzorcích pocházejících z karcinomu ovaria byla provedena v roce 2007 [7]. V této studii byla identifikována rodina miR-200, která je tvořena pěti různými miRNA, které mohou vykazovat jak onkogenní, tak i tumor supresorové vlastnosti. Další významnou skupinou miRNA s deregulovanou hladinou u karcinomů ovarií je rodina let-7, jejímž hlavním cílem je gen HMGA2 [8], který se uplatňuje při modulaci chromatinu a přispívá tak k regulaci transkripce. Jeho zvýšená hladina byla opakovaně prokázána u serózních karcinomů vaječníku a to jak v raných, tak i pozdějších stadiích [8]. Skutečnost, že v naší práci pozorujeme zvýšenou hladinu let-7b naznačuje, že zřejmě došlo k aktivaci této tumor supresorové dráhy, nicméně exprese genu HMGA2 nebyla stanovena.

Změny v hladinách exprese miR-30a-5p byly detekovány v souvislosti s rezistencí k cisplatině u ovariálních buněčných linií [9]. Následující studie pak ukázala, že hladina miR-30a-5p je signifikantně zvýšená u buněčných linií, které vykazují rezistenci k chemoterapii. Spolu s tím zvýšená exprese této miRNA přispívala nejen k rychlejšímu růstu tumoru, ale i ke schopnosti migrovat a k invazivitě [10].

Abnormální exprese miR-26b byla popsána u řady nádorových onemocnění. Dále bylo zjištěno, že c-Myc, klasický onkogen, suprimuje expresi miR-26b u různých tumorů [11]. Na druhou stranu, zvýšená exprese miR-26b byla popsána u high-grade gliomů, kde bylo rovněž prokázáno, že 3’UTR mRNA nádorového supresoru PTEN je cílovým místem pro miR-26b. V případě karcinomu vaječníku existují v odborné literatuře stran miR-26 rovněž rozporuplné údaje [12,13].

Naše pilotní studie identifikovala miR-30a-5p a miR-26b jako potenciální markery karcinomu vaječníku, avšak je třeba si uvědomit, že vyšetřovaným materiálem bylo pouze sérum pacientek, kde hladiny miRNA nemusí plně korelovat s expresí miRNA v nádorové tkáni vaječníku. Naopak, v případě analýzy exprese miRNA v krevním séru lze předpokládat systémový obrázek v kontextu celého organizmu, kde se mohou aberantně exprimovat nejrůznější miRNA vč. miRNA reflektujících nádorové onemocnění a jejichž identifikace a validace by mohla v budoucnu sloužit především k diagnostickým účelům.

Práce byla podpořena grantem MŠMT – NPU I – LO1413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Lucia Sommerová

RECAMO

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: lucia.sommerova@mou.cz

Obdrženo: 13. 3. 2017

Přijato: 26. 3. 2017