Význam deregulace mikroRNA v molekulární patogenezi a histologické transformaci folikulárního lymfomu

Česká verzia English info

The Importance of MicroRNA Deregulation in the Molecular Pathogenesis and Histological Transformation of Follicular Lymphoma

Background:
Molecular pathogenesis of follicular lymphoma (FL) is characterized by substantial dysregulation of epigenetic regulators. Many cases of FL are associated with the aberrant expression of non-coding regulatory RNAs, namely microRNAs (miRNA). Here we studied changes in miRNA expression and their association with histological transformation of FL to diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL).

Material and Methods:
To identify changes in miRNA levels during FL transformation we performed a global expression analysis of 377 miRNAs in 16 samples (8 pairs) from FL patients vs. transformed FL (tFL) (TLDA miRNA cards; Thermo Fisher Scientific). The association of miRNA expression with clinical-biological characteristics and target proteins were further analyzed in a cohort of 89 FL patients.

Results:
The miRNA expression profiling of paired FL-tFL samples revealed statistically significant changes in the expression of five miRNAs (p < 0.05). Four of them were down-regulated and one was up-regulated in tFL compared to FL. Lower levels of one of these miRNA were also associated with higher proliferation rate of FL cells (Ki-67 > 20%), higher FLIPI score (≥ 3) and shorter overall survival of FL patients. Furthermore, we found that this miRNA regulates the levels of FOXP1 protein in FL. The patients with high-level FOXP1 expression (> 70% positive cells) had significantly shorter overall survival in comparison to those with low-level FOXP1 expression (< 30% positive cells). Moreover, FOXP1 protein levels were higher in most tFL samples compared to FL before transformation.

Conclusion:
We found miRNAs associated with the transformation of FL to a more aggressive DLBCL, and described that one of them could serve as a prognostic marker. We found that reduced expression of this tFL-associated miRNA results in increased levels of FOXP1 protein and we assume that the increased activity of FOXP1 proto-oncogene contributes to the histological transformation of FL.

Key words:
follicular lymphoma – microRNA – histological transformation

This work was supported by Czech Ministry of Health registration No. 16-29622A. All rights reserved.

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

Submitted:
5. 3. 2017

Accepted:
26. 3. 2017

Autoři: K. Musilová ^1,2; J. Deván ^1,2; L. Zlámalíková ³; L. Křen ³; H. Mociková ⁴; V. Procházka ⁵ ; J. Mayer ¹; M. Trněný ⁶; A. Janíková ¹; M. Mráz ^1,2
Působiště autorů: Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno ¹; Centrum molekulární medicíny, CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno ²; Ústav patologie, FN Brno ³; Interní hematologická klinika 3. LF UK a FN Královské Vinohrady, Praha ⁴; Hemato-onkologická klinika LF UP a FN Olomouc ⁵; I. interní klinika – klinika hematologie 1. LF UK a VFN v Praze ⁶
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2017; 30(Supplementum1): 163-165
Kategorie: Článek ve sborníku

Souhrn

Východiska:
Molekulární patogeneze folikulárního lymfomu (FL) je charakteristická významnou úlohou deregulace epigenetických regulátorů. Významná část případů FL je spojena s aberantní expresí krátkých nekódujících regulačních molekul, tzv. mikroRNA (miRNA). V naší práci jsme studovali asociaci změn exprese miRNA s histologickou transformací FL do difuzního velkobuněčného B lymfomu (DLBCL).

Materiál a metody:
Pro identifikaci změn hladin miRNA během transformace FL byla provedena globální analýza exprese 377 miRNA u 16 vzorků (8 párů) pacientů s FL vs. transformovaným FL (tFL) (TLDA miRNA karty; Thermo Fisher Scientific). Asociace exprese vybraných miRNA s klinicko-biologickými charakteristikami a cílovými proteiny byla dále analyzována v kohortě 89 pacientů s FL.

Výsledky:
Analýza párových FL-tFL odhalila pět miRNA se statisticky významnou změnou exprese (p < 0,05). Čtyři miRNA vykazovaly sníženou expresi a jedna miRNA zvýšenou expresi v tFL oproti FL. Nižší hladiny jedné z těchto miRNA byly asociovány s vyšší proliferační aktivitou FL buněk (Ki-67 > 20 %), vyšším rizikovým skóre FLIPI (≥ 3) a kratším celkovým přežitím pacientů. Dále jsme potvrdili, že tato miRNA reguluje ve FL hladiny proteinu FOXP1. Pacienti s vysokou expresí FOXP1 (> 70 % pozitivních buněk) měli kratší celkové přežití ve srovnání s pacienty s nízkou expresí FOXP1 (< 30 % pozitivních buněk). Hladiny proteinu FOXP1 byly také vyšší ve většině vzorků tFL oproti FL před transformací.

Závěr:
Popsali jsme miRNA spojené s transformací FL do agresivnějšího DLBCL a konkrétní miRNA, která může sloužit jako dobrý prognostický marker. Zjistili jsme, že na úrovni molekulárních drah se pokles hladin této tFL-asociované miRNA projevuje zvýšenou expresí FOXP1 a předpokládáme, že právě zvýšená aktivita tohoto proto-onkogenu přispívá k histologické transformaci FL.

Klíčová slova:
folikulární lymfom – mikroRNA – histologická transformace

Folikulární lymfom (FL) je nejčastějším typem indolentního nehodgkinského lymfomu s incidencí 3–4/100 000 za rok. Navzdory výraznému zlepšení přežití pacientů po zavedení imunoterapie zůstává toto onemocnění dodnes nevyléčitelným [1]. Jeho průběh je charakteristický opakovanými relapsy vedoucími ke vzniku rezistentního onemocnění nebo k transformaci do agresivnějšího typu lymfomu (typicky difuzního velkobuněčného B lymfomu – DLBCL). První náhled do molekulární podstaty FL přinesly práce, které identifikovaly přítomnost translokace genu BCL2 do oblasti pod vlivem zesilovačů IGH genů u téměř všech případů tohoto nemocnění [2]. Detailnější pochopení mechanizmů řídících vznik a vývoj této malignity umožnil však až rozvoj metod sekvenování nové generace. Takto byly identifikovány desítky dalších aberací, z nichž mnohé jsou sdíleny většinou pacientů [3]. Proces histologické transformace, kterému podléhá 30–40 % pacientů s FL, s sebou navíc nese další specifické aberace [4]. Patogeneze FL je komplexní souhrou vzájemných interakcí deregulovaných onkogenů, tumor supresorů, epigenetických regulátorů a faktorů nádorového mikroprostředí. Pochopení molekulárních mechanizmů, které jsou zodpovědné za vznik, vývoj a transformaci FL, je důležitou součástí cesty ke zlepšení stratifikace pacientů do prognostických skupin a k vývoji účinné cílené léčby.

Specifické postavení mezi epigenetickými regulátory zaujímají malé nekódující regulační molekuly RNA, tzv. mikroRNA (miRNA). Tyto posttranskripční regulátory genové exprese jsou zapojeny v regulaci klíčových buněčných procesů a známý vztah jejich deregulace k vývoji některých hematoonkologických onemocnění (chronická lymfocytární leukemie – CLL, DLBCL atd.) umožňoval předpokládat jejich významné postavení také u FL. Skutečně se zdá, že deregulace miRNA je součástí patogeneze mnoha případů FL a změny hladin některých z nich mohou ovlivnit proces histologické transformace FL [5].

Množství miRNA deregulovaných u FL přímo či nepřímo ovlivňuje signalizaci z B buněčného receptoru (BCR) maligních B buněk. Pro lepší pochopení dopadu jejich deregulace se musíme zaměřit na fyziologické úlohy jejich cílových molekul. Po stimulaci BCR dochází k fosforylaci tyrozinkináz SRC a SYK, což umožní konverzi PIP2 na PIP3 zprostředkovanou kinázou PI3K. PIP3 je druhým poslem s klíčovou rolí v aktivaci mnoha vnitrobuněčných signálních kaskád, jehož tvorba je přímo vázána na aktivaci povrchových receptorů [6]. Samotná konverze je velice precizně regulována tyrozin fosfatázami (PTEN, SHIP-1, PTPN11, PTPRJ), jejichž hladiny zase souvisí s aktivitou miRNA (miR-21, miR-155, klastr miR-17-92) [7]. Kromě delecí genů pro zmíněné fosfatázy jsou právě zvýšené hladiny těchto miRNA jednou z hlavních příčin aberantní BCR signalizace v buňkách FL. Zvýšené hladiny jedné z těchto miRNA (miR-17-5p) byly popsány rovněž v souvislosti s histologickou transformací FL [5], kde zřejmě souvisí se zvýšenou expresí MYC, který je přímým aktivátorem miR-17-92 [8].

Podobně jako protein kódující geny, také miRNA fungují jako onkogeny i tumor supresory a jejich rovnováha je klíčem k homeostáze na buněčné i tkáňové úrovni. Onkogenní aktivita zmíněných miRNA je fyziologicky balancována tumor supresorovými miR-150 a miR-31. Korelace poklesu hladiny miR-31 s procesem histologické transformace byla již popsána, přičemž klíčovým důsledkem této deregulace je zřejmě patologické zvýšení exprese PI3K a transkripčního faktoru E2F2 [5]. V případě miR-150 byla sice popsána její snížená exprese u CLL v asociaci se špatnou prognózou [9], avšak její dopad na chování nádorových buněk a prognózu pacientů u FL zatím zkoumán nebyl. V naší práci jsme se zaměřili na analýzu změn hladin miRNA v průběhu histologické transformace FL a z 377 analyzovaných miRNA právě miR-150 vykazovala změnu nejvýznamnější. Nízké hladiny této miRNA byly také spjaty s významně vyšší proliferační aktivitou buněk (Ki-67 > 20 %) a vyšší hodnotou prognostického indexu FLIPI (≥ 3). Retrospektivní analýza přežívání navíc ukázala, že pacienti s nízkými hladinami miR-150 přežívají významně kratší dobu než pacienti s vyšší (> medián) expresí miR-150 (medián přežití 6,2 let vs. nedosažen). Je tedy pravděpodobné, že tato miRNA hraje v patogenezi FL významnou roli, zbývá však objasnit její funkce na úrovni vnitrobuněčné signalizace. Již dříve jsme prokázali schopnost miR-150 tlumit BCR signalizaci prostřednictvím inhibice proteinů GAB1 a FOXP1 u CLL [9]. Tyto výsledky a také dříve popsaná asociace zvýšených hladin FOXP1 se špatnou prognózou u FL a DLBCL byly důvodem ke zkoumání vztahu deregulace miR-150 k expresi FOXP1 v našem souboru pacientů s FL a tFL [9–11]. Imunohistochemické hodnocení vzorků ukázalo, že hladiny miR-150 jsou u pacientů s vysokou hladinou proteinu FOXP1 (> 70 % pozitivních buněk) významně nižší oproti nízce či středně FOXP1-pozitivním vzorkům. Vysoká hladina proteinu FOXP1 navíc souvisela s významně kratším přežitím FL pacientů oproti pacientům s nízkými hladinami FOXP1. V souladu s klesající hladinou miR-150 při histologické transformaci jsme rovněž detekovali vyšší expresi FOXP1 v tFL oproti FL před transformací.

Naše výsledky ukazují, že proces histologické transformace FL je asociován se změnami hladin některých miRNA. Jako první jsme identifikovali asociaci tohoto procesu s poklesem tumor supresorové miR-150 a alespoň z části objasnili molekulární mechanizmus, kterým snižování hladiny této miRNA k transformaci FL přispívá. V současné době se intenzivně věnujeme objasnění mechanizmů, které vedou ke snížené expresi miR-150 a identifikaci dalších cílových genů a bio-logických procesů, jež tato miRNA v buňkách FL reguluje.

Práce byla podpořena z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. 16-29622A. Veškerá práva podle předpisů na ochranu duševního vlastnictví jsou vyhrazena.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Kateřina Musilová

Centrum molekulární biologie a genové terapie

Interní hematologická a onkologická klinika

LF MU a FN Brno

Černopolní 9

625 00 Brno

e-mail: musilova.kate@gmail.com

Obdrženo: 5. 3. 2017

Přijato: 26. 3. 2017

Zdroje

1. Benešová K, Trněný M. Folikulární lymfom. Klin Onkol 2015; 28 (Suppl 3): 3S73–3S79. doi: 10.14735/amko20153S73.

2. Tsujimoto Y, Cossman J, Jaffe E et al. Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma. Science 1985; 228 (4706): 1440–1443.

3. Okosun J, Bödör C, Wang J et al. Integrated genomic analysis identifies recurrent mutations and evolution patterns driving the initiation and progression of follicular lymphoma. Nat Genet 2014; 46 (2): 176–181.

4. Pasqualucci L, Khiabanian H, Fangazio M et al. Genetics of follicular lymphoma transformation. Cell Rep 2014; 6 (1): 130–140. doi: 10.1016/j.celrep.2013.12.027.

5. Thompson MA, Edmonds MD, Liang S et al. miR-31 and miR-17-5p levels change during transformation of follicular lymphoma. Hum Pathol 2016; 50: 118–126. doi: 10.1016/j.humpath.2015.11.011.

6. Mráz M, Doubek M, Mayer J. Inhibice signalizace B buněčným receptorem: první cílená léčba u chronické lymfocytární leukemie a dalších B buněčných lymfomů. Klin Onkol 2013; 26 (3): 179–185.

7. Musilova K, Mraz M. MicroRNAs in B-cell lymphomas: how a complex biology gets more complex. Leukemia 2015; 29 (5): 1004–1017. doi: 10.1038/leu.2014.351.

8. O’Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI et al. c-Myc-regulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature 2005; 435 (7043): 839–843.

9. Mraz M, Chen L, Rassenti LZ et al. miR-150 influences B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia by regulating expression of GAB1 and FOXP1. Blood 2014; 124 (1): 84–95. doi: 10.1182/blood-2013-09-527 234.

10. Banham AH, Connors JM, Brown PJ et al. Expression of the FOXP1 transcription factor is strongly associated with inferior survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Clin Cancer Res 2005; 11 (3): 1065–1072.

11. Green MR, Gandhi MK, Courtney MJ et al. Relative abundance of full-length and truncated FOXP1 isoforms is associated with differential NFkappaB activity in follicular lymphoma. Leuk Res 2009; 33 (12): 1699–1702. doi: 10.1016/j.leukres.2009.05.004.