Využití metody PLA pro detekci komplexů p53/p63/p73 in situ v nádorových buňkách a nádorové tkáni

Application of PLA Method for Detection of p53/p63/p73 Complexes in Situ in Tumour Cells and Tumour Tissue

Background:
PLA (proximity ligation assay) can be used for detection of protein-protein interactions in situ directly in cells and tissues. Due to its high sensitivity and specificity it is useful for detection, localization and quantification of protein complexes with single molecule resolution. One of the mechanisms of mutated p53 gain of function is formation of proten-protein complexes with other members of p53 family – p63 and p73. These interactions influences chemosensitivity and invasivity of cancer cells and this is why these complexes are potential targets of anti-cancer therapy. The aim of this work is to detect p53/p63/p73 interactions in situ in tumour cells and tumour tissue using PLA method.

Material and Methods:
Unique in-house antibodies for specific detection of p63 and p73 isoforms were developed and characterized. Potein complexes were detected using PLA in established cell lines SVK14, HCC1806 and FaDu and in paraffin sections of colorectal carcinoma tissue. Cell lines were also processed to paraffin blocks.

Results:
p53/T-antigen and ΔNp63/T-antigen protein complexes were detected in SVK14 cells using PLA. Interactions of ΔNp63 and TAp73 isoforms were found in HCC1806 cell line with endogenous expression of these proteins. In FaDu cell line mut-p53/TAp73 complex was localized but not mut-p53/ΔNp63 complex. p53 tetramer was detected directly in colorectal cancer tissue.

Conclusion:
During development of PLA method for detection of protein complexes between p53 family members we detected interactions of p53 and p63 with T-antigen and mut-p53 and ΔNp63 with TAp73 tumour suppressor in tumour cell lines and p53 tetramers in paraffin sections of colorectal cancer tissue. PLA will be further used for detection of p53/p63, p53/p73 and p63/p73 interactions in tumour tissues and it could be also used for screening of compounds that can block formation of p53/p63/p73 protein complexes.

Key words:
p53 protein family – protein interaction mapping – immunofluorescence

This work was supported by MEYS – NPS I – LO1413.

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

Submitted:
13. 3. 2017

Accepted:
26. 3. 2017

Autori: V. Hrabal; M. Nekulová; R. Nenutil; J. Holčáková; P. J. Coates; B. Vojtěšek
Pôsobisko autorov: RECAMO, Masarykův onkologický ústav, Brno
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2017; 30(Supplementum1): 159-162
Kategória: Článek ve sborníku

Súhrn

Východiska:
PLA (proximity ligation assay) je metoda umožňující detekovat protein-proteinové interakce in situ přímo v buňce nebo tkáni. Její hlavní výhodou je vysoká citlivost a specificita umožňující detekovat, lokalizovat a kvantifikovat proteinové komplexy s vysokým rozlišením až jednotlivých molekul. Jedním z mechanizmů „gain of function“ mutovaného p53 je tvorba komplexů s dalšími členy proteinové rodiny p53 – p63 a p73. Tyto interakce pak mají přímý vliv na chemosenzitivitu nádorových buněk a jejich invazivní potenciál, a proto jsou komplexy p53/p63/p73 nadějným cílem protinádorové terapie. Cílem této práce je prokázat existenci komplexů p53/p63/p73 in situ v nádorových buňkách a v nádorové tkáni na parafinových řezech s využitím metody PLA.

Materiál a metody:
Pro detekci izoforem p63 a p73 byly na našem pracovišti charakterizovány unikátní specifické protilátky. Proteinové komplexy byly detekovány metodou PLA ve stabilních buněčných liniích SVK14, HCC1806 a FaDu a na parafinových řezech z tkáně kolorektálního karcinomu. Buněčné linie byly zpracovány do parafinových bloků, aby je bylo možné využít jako model pro optimalizaci protokolu pro barvení tkáňových řezů.

Výsledky:
V buňkách SVK14 exprimujících virový T antigen jsme metodou PLA detekovali komplex p53/T antigen a ΔNp63/T antigen. Interakci izoforem ΔNp63 a TAp73 jsme zaznamenali v linii HCC1806 s endogenní expresí těchto proteinů. V linii FaDu byl lokalizován komplex mut-p53/TAp73, ne však mut-p53/ΔNp63. Přímo v nádorové tkáni kolorektálního karcinomu se podařilo detekovat tetramer mutovaného p53.

Závěr:
V rámci vývoje metody PLA pro detekci komplexů proteinů z rodiny p53 jsme v nádorových buněčných liniích detekovali komplexy p53 a p63 s T antigenem, komplexy mutovaného p53 a ΔNp63 s nádorovým supresorem TAp73 a na parafinových řezech kolorektálního karcinomu tetramery p53. Další vývoj metody bude směřovat k detekci komplexů p53/p63, p53/p73 a p63/p73 v nádorové tkáni a testování možnosti využití PLA pro screening látek blokujících tvorbu těchto komplexů.

Klíčová slova:
proteinová rodina p53 – mapování proteinových interakcí – imunofluorescence

Východiska

PLA (proximity ligation assay) je metoda umožňující detekovat protein-proteinové interakce in situ přímo v buňce nebo tkáni. Ve srovnání s dalšími metodami používanými ke studiu proteinových komplexů (imunoprecipitace, dvouhybridový systém atd.) je její hlavní výhodou vysoká citlivost a specificita umožňující detekovat, lokalizovat a kvantifikovat proteinové komplexy s vysokým rozlišením až jednotlivých molekul [1].

Jednou z nejčastějších genetických změn v nádorových buňkách je mutace genu TP53, kódujícího nádorový supresor p53. Důsledkem je nejen ztráta funkce tohoto proteinu při ochraně buněk před nádorovou transformací, ale často i zisk nových funkcí, které aktivně přispívají k progresi nádorového onemocnění [2]. Jedním z mechanizmů „gain of function“ mutovaného p53 je tvorba komplexů (heterooligomerů) s dalšími členy proteinové rodiny p53 – p63 a p73. Geny TP63 a TP73 kódují proteinové izoformy s dominantně onkogenním efektem (ΔNp63, ΔNp73) a izoformy s funkcí nádorových supresorů (TAp63, TAp73). Protože všechny proteiny z rodiny p53 tvoří tetramery a mají podobnou strukturu, je předpokládána i schopnost vzájemné interakce těchto proteinů a jejich izoforem. Existence heterooligomerů p53/p63/p73 byla prokázána in vitro s využitím různých přístupů [3]. Z řady experimentů vyplývá, že p63 může interagovat s p73 a oba proteiny mohou tvořit komplexy s některými mutantními formami p53 [4,5]. Tyto interakce pak mají přímý vliv na chemosenzitivitu nádorových buněk a jejich invazivní potenciál [6–8], a proto jsou komplexy p53/p63/p73 nadějným cílem protinádorové terapie, přičemž nezbytným předpokladem je prokázání jejich skutečného výskytu v nádorové tkáni. Cílem této práce je proto prokázat existenci komplexů p53/p63/p73 in situ v nádorových buňkách a v nádorové tkáni na parafinových řezech s využitím metody PLA.

Materiál a metody

Princip metody PLA spočívá v použití dvou primárních protilátek, které specificky rozpoznávají cílové proteiny, u kterých je předpokládána vzájemná interakce. Primární protilátky mohou být přímo značeny PLA sondou tvořenou krátkým oligonukleotidem, nebo jsou pro jejich detekci využity značené sekundární protilátky (obr. 1). Tvoří-li cílové proteiny komplex, navážou se primární i sekundární protilátky v dostatečné blízkosti a po přidání dalších dvou oligonukleotidů je vytvořena kružnicová ssDNA. Jedna z PLA sond dále slouží jako primer při amplifikaci DNA („rolling circle amplification“). Vzniká tak dlouhá molekula DNA, která je vizualizována hybridizací detekčních fluorescenčně značených oligonukleotidů, jejichž signál je pozorován pomocí fluorescenčního mikroskopu. Pro specifickou detekci izoforem p63 a p73 byly na našem pracovišti charakterizovány myší monoklonální a králičí polyklonální protilátky [9]. Jako modelová linie byly využity buňky SVK14, což jsou lidské keratinocyty transformované virem SV40, a další stabilní nádorové buněčné linie (HCC1806, FaDu). Tetramery p53 byly detekovány v parafinových řezech z tkáně kolorektálního karcinomu. Buněčné linie byly také zpracovány do parafinových bloků, aby je bylo možné využít jako model pro optimalizaci protokolu pro barvení tkáňových řezů. Použité protilátky – p53: DO-1, Bp53-10.1, PAb 1801, CM-1; p63: ΔNp63-1.1, ΔNp63-111, TAp63-4.1; p73: TAp73-1.1, IHC00197 (Bethyl Laboratories); T antigen: PAb 416, 115; sekundární protilátky pro PLA: Duolink (Sigma-Aldrich).

Výsledky

Podmínkou pro úspěšnou detekci komplexů p53/p63/p73 a jejich izoforem byl vývoj protilátek s vysokou specifitou, které na rozdíl od komerčně dostupných protilátek nereagují s ostatními členy proteinové rodiny. Všechny protilátky byly otestovány pomocí imunofluorescenčního a imunohistochemického barvení. Jako modelová linie pro aplikaci metody PLA byly vybrány buňky SVK14 exprimující T antigen (SV40 large T-antigen), což je známý interakční partner proteinu p53 [10]. Komplex p53/ /T antigen se podařilo detekovat pomocí nepřímé PLA s využitím kombinace myších monoklonálních protilátek proti N-konci p53 (DO-1, PAb 1801) a králičí polyklonální protilátky proti T antigenu (115) (obr. 2A). V buňkách SVK14 jsme imunocytochemickým barvením zjistili také výskyt populace buněk exprimujících ΔNp63 a následně jsme zde úspěšně detekovali interakci ΔNp63/T antigen s využitím protilátek ΔNp63-1.1 a 115. Pro studium interakcí mezi izoformami p63 a p73 jsme zvolili linii HCC1806 odvozenou od triple negativního karcinomu prsu s endogenní expresí těchto proteinů. S využitím primárních protilátek ΔNp63-1.1 a IHC00197 a značených sekundárních protilátek jsme detekovali komplex ΔNp63/TAp73. V linii FaDu odvozené od karcinomu hltanu jsme detekovali komplex mut-p53/TAp73, ne však mut-p53/ΔNp63. Dalším krokem byla detekce proteinového komplexu p53 přímo v nádorové tkáni. Byl zvolen tetramer p53 a kolorektální karcinom, pro který je typická vysoká četnost mutací p53 a s tím spojená vysoká hladina tohoto proteinu. Protilátky proti různým doménám p53 byly značeny sondami pro PLA a použity pro přímou detekci. Tetramer p53 se nám podařilo detekovat s využitím kombinace protilátek DO-1 s Bp53-10.1 a CM-1 s Bp53-10.1 (rozpoznávají vždy N-a C-koncovou část proteinu) (obr. 2B).

**Obr. 2. Detekce proteinových komplexů pomocí PLA.**

Diskuze a závěr

V rámci vývoje metody PLA pro detekci komplexů proteinů z rodiny p53 jsme charakterizovali protilátky specificky rozpoznávající jednotlivé izoformy proteinů p63 a p73. V modelové linii imortalizovaných keratinocytů jsme detekovali komplexy p53 a p63 s T antigenem, v dalších nádorových buněčných liniích pak i komplexy mutovaného p53 a ΔNp63 s nádorovým supresorem TAp73. Přímo na parafinových řezech kolorektálního karcinomu jsme pomocí PLA detekovali tetramery p53. O specifitě detekce proteinových komplexů svědčí jejich jaderná lokalizace, nicméně je třeba ji dále ověřit dostatečným počtem pozitivních a negativních kontrol (buňky s indukovanou a naopak potlačenou expresí jednotlivých genů/proteinů). Další vývoj metody bude směřovat k detekci komplexů p53/p63, p53/p73 a p63/p73 v nádorové tkáni a testování možnosti využití PLA pro screening látek blokujících tvorbu těchto komplexů.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413.NPU I – LO1413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Marta Nekulová, Ph.D.

RECAMO

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: marta.nekulova@mou.cz

Obdrženo: 13. 3. 2017

Přijato: 26. 3. 2017

Zdroje

1. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods 2006; 3 (12): 995–1000.

2. Oren M, Rotter V. Mutant p53 gain-of –function in cancer. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010; 2 (2): a001107. doi: 10.1101/cshperspect.a001107.

3. Melino G. p63 is a suppressor of tumorigenesis and metastasis interacting with mutant p53. Cell Death Differ 2011; 18 (9): 1487–1499. doi: 10.1038/cdd.2011.81.

4. Di Como CJ, Gaiddon C, Prives C. p73 function is inhibited by tumor-derived p53 mutants in mammalian cells. Mol Cell Biol 1999; 19 (2): 1438–1449.

5. Davison TS, Vagner C, Kaghad M et al. p73 and p63 are homotetramers capable of weak heterotypic interactions with each other but not with p53. J Biol Chem 1999; 274 (26): 18709–18714.

6. Leong CO, Vidnovic N, DeYoung MP et al. The p63/p73 network mediates chemosensitivity to cisplatin in a biologically defined subset of primary breast cancers. J Clin Invest 2007; 117 (5): 1370–1380.

7. Adorno M, Cordenonsi M, Montagner M et al. A mutant-p53/Smad complex opposes p63 to empower TGFbeta-induced metastasis. Cell 2009; 137 (1): 87–98. doi: 10.1016/j.cell.2009.01.039.

8. Muller PA, Caswell PT, Doyle B et al. Mutant p53 drives invasion by promoting integrin recycling. Cell 2009; 139 (7): 1327–1341. doi: 10.1016/j.cell.2009.11. 026.

9. Nekulova M, Holcakova J, Nenutil R et al. Characterization of specific p63 and p63-N-terminal isoform antibodies and their application for immunohistochemistry. Virchows Arch 2013; 463 (3): 415–425. doi: 10.1007/s00428-013-1459-4.

10. Pipas JM, Levine AJ. Role of T antigen interactions with p53 in tumorigenesis. Semin Cancer Biol 2001; 11 (1): 23–30.