Programovaná buněčná smrt v nádorových buňkách

Súhrn

Rezistence k indukci smrti je jedním z charakteristických znaků nádorové buňky, jež ovlivňuje od počátku jak samotný proces neoplastické transformace, tak i pozdější odpověď na onkologickou léčbu. Cílem tohoto přehledového článku je shrnout recentní informace o programované buněčné smrti zdravých i nádorových buněk a o nových možnostech protinádorové terapie zacílené na tyto signální dráhy. Podrobněji jsou popsány tři hlavní typy: apoptóza, programovaná nekróza a buněčná smrt spojená s autofagií. Především apoptóza hraje významnou roli nejen při neoplastické transformaci buňky, ale i jako jeden z faktorů určujících úspěšnost protinádorové terapie. V textu je podán přehled hlavních signálních drah a molekul podílejících se na regulaci apoptózy ve zdravých buňkách. Většina nádorových buněk nese mutace v proteinech přímo či nepřímo se účastnících indukce a exekuce buněčné smrti, jako jsou proteiny p53, členové rodiny Bcl‑ 2, proteiny inhibující apoptózu (IAPs), receptory/ ligandy smrti a další. U těchto významných regulátorů jsou popsány jejich nejčastější mutace či změny exprese vyskytující se v buňkách konkrétních typů nádorů. Na závěr je podán přehled ně­kte­rých nových léčiv zaměřených na modulaci programované buněčné smrti, jež právě procházejí klinickými zkouškami. Díky intenzivnímu výzkumu je možné stále detailnější porozumění procesům, které v umírající buňce probíhají, a na jejich základě pak lze navrhovat léčiva nové generace, jež v kombinaci s tradiční terapií umožní významné zlepšení odpovědi na protinádorovou terapii.

Klíčová slova:
programovaná buněčná smrt –  apoptóza –  nekroptóza –  autofagie –  kaspázy –  Bcl‑ 2

Úvod

Proces postupné přeměny normální buňky v nádorovou ústí ve fatální změnu jejích vlastností souvisejících především s regulací růstu, schopností přežít a šířit se v organizmu. Tyto základní vlastnosti maligních buněk jsou popsány v respektovaném článku Hanahana a Weinberga [1]. Mezi nejdůležitější charakteristické znaky nádorové buňky tito autoři zařadili i její schopnost uniknout indukci programované buněčné smrti. Nádorové buňky produkují řadu signálů, které za normálních okolností aktivují signální dráhy vedoucí k eliminaci těchto buněk –  obsahují poškozenou DNA, aktivované onkogeny, jsou vystaveny oxidativnímu stresu atd. Ty z nich, které získají mutace umožňující zablokovat proces jejich odstranění programovanou buněčnou smrtí, vytváří rezistentní klony a v organizmu dále přežívají a neregulovaně se množí.

Převládající paradigma nádorové terapie předpokládá, že buňky, které jsou citlivé k indukci apoptózy, budou na léčbu odpovídat lépe než ty, jež jsou k indukci apoptózy a tím i k léčbě rezistentní. Základní výzkum, jenž odhaluje signální dráhy a mechanizmy klasické apoptózy i alternativních typů buněčné smrti, poskytuje znalosti, na základě kterých lze vyvíjet nová léčiva a kombinovat je s tradiční protinádorovou terapií. Tato nová léčiva jsou většinou zaměřena na reaktivaci apoptotické dráhy a zvyšují tak úspěšnost eliminace nádorových buněk, jež by jinak byly k indukci smrti více rezistentní.

Typy programované buněčné smrti

Podle toho, jaké morfologické a jiné znaky umírající buňka vykazuje, lze programovanou buněčnou smrt (program­med cell death –  PCD) klasifikovat do ně­kte­rého ze základních typů [2]. Morfologie buňky může být apoptotická, nekrotická, autofagická či spojená s mitózou. Historicky nejstarší typ identifikované PCD je apoptóza, popsaná již před více než 40 lety [3]. Nekroptóza a buněčná smrt asociovaná s autofagií jsou další dva typy PCD popsané u nejrůznějších typů buněk. Typická morfologie normální, apoptotické, autofagické a nekrotické buňky, nasnímaná na elektronovém mikroskopu, je na obr. 1. Pro úplnost: čtvrtý oficiálně uznávaný, ač vysoce specifický typ programované buněčné smrti je tzv. kornifikace neboli tvorba zrohovatělé vrstvy kůže z mrtvých keratinocytů v pevném proteinovém obalu [4]. Další typy buněčné smrti, které jsou v literatuře často uváděny (anoikis, excitotoxicita, Wallerova degradace, mitotická katastrofa, para­ptóza, pyroptóza, entóza a pyronekróza), se zatím nedoporučuje klasifikovat jako samostatné druhy programované buněčné smrti [2].

Kromě morfologických znaků jsou dalším kritériem funkční aspekty, kterými rozlišujeme buněčnou smrt fyziologickou, patologickou, náhodnou či programovanou. Enzymologicky pak lze určit, do jaké míry jsou aktivovány nukleázy a proteázy různých tříd. Aktivace různých typů buněčné smrti se v jednotlivých buňkách vzájemně nevylučuje, naopak mohou spolupracovat či sdílet ně­kte­ré signální molekuly [5]. Jsou‑li např. makrofágy ve tkáních vystaveny různým stresorům, je většinou současně indukováno více typů buněčné smrti, přičemž apoptóza probíhá nejrychleji, zatímco autofagie nebo nekróza jsou obvykle pozorovatelné až v případě, kdy je apoptóza inhibována [6].

Apoptóza

Termín „apoptosis“ jako první použil J. F. Kerr při objevu a popsání regulované buněčné smrti [3]. Buňka umírající apoptózou vykazuje charakteristické morfologické změny, které ji odlišují od nekrózy –  kondenzace a fragmentace chromatinu v jádře, tvorba výběžků cytoplazmatické membrány (membránové puchýřky), celkové zmenšení a zakulacení buňky a v pozdních fázích rozpad celé buňky do tzv. apoptotických tělísek [2]. Tato tělíska obsahují stále funkční organely, fragmenty kondenzovaného jádra a udržují si intaktní membránu, která se od membrány zdravých buněk liší přítomností fosfatidylserinu na její vnější straně [7]. To umožňuje rozpoznání a následné pohlcení apoptotických tělísek sousedními buňkami či buňkami imunitního systému [8]. Z bio­chemického hlediska jsou v umírající buňce typicky aktivovány proteolytické enzymy –  kaspázy, které štěpí řadu cílových proteinů, a nukleázy, degradující DNA.

Aby buňka mohla zahájit proces své vlastní eliminace, musí obdržet odpovídající signály. Na obr. 2 jsou zjednodušeně znázorněny dvě hlavní signální kaskády vedoucí k apoptóze v savčích buňkách. Vnější dráha je aktivována vazbou ligandů smrti (TRAIL, FasL, TNF) na receptory smrti (DR4/ DR5, Fas, TNFR a další), které tvoří trimery, a přes další adaptorové proteiny aktivují prokaspázu‑ 8, případně prokaspázu‑ 10 [9,10]. Vnitřní dráha je odpovědná za iniciaci apoptózy v případě neopravitelného poškození DNA. Je to tedy dráha aktivovaná obvykle při onkologické terapii, a proto bude popsána detailněji. Do její regulace se zapojuje celá řada pro‑ i anti‑apoptotických proteinů. Poškození DNA vede ke stabilizaci a aktivaci proteinu p53, který apoptotický signál dále přenáší především prostřednictvím regulace proteinů rodiny Bcl‑ 2 [11]. Role proteinu p53 v regulaci apoptotické dráhy je komplexnější a pro podrobnější studium odkazujeme na přehledové články jiných autorů [12,13].

Zásadní událostí v klasické apoptotické signalizaci je částečná permeabilizace mitochondriální membrány, jež vede k uvolnění pro‑apoptotických molekul z mezimembránového mitochondriálního prostoru do cytozolu. Do procesu uvolňování těchto proteinů z mitochondrií významně zasahují další proteiny přítomné v membráně mitochondrií nebo v cytoplazmě, především ty z rodiny Bcl‑ 2 [14,15]. Tato rodina, do které bylo doposud zařazeno 25 proteinů, je charakterizována přítomností BH‑ domén (Bcl‑ 2 homology) v jejich struktuře. Podle jejich funkce se rozlišují na anti‑apoptotické (Bcl‑ 2, Bcl‑ XL, Mcl‑ 1, Bcl‑ W, A1), pro‑apoptotické efektorové (Bak, Bax), pro‑apoptotické přímé aktivátory (Bid, Bim) či nepřímé aktivátory (Bad, Bik, BMF, HRK, Puma, Noxa) [16]. Aktivátory Bid a Bim po přijetí apoptotického signálu indukují oligomerizaci Bak a Bax, což vede k jejich translokaci z cytoplazmy do membrány mitochondrií a k vytvoření pórů ve vnější mitochondriální membráně. Pro‑apoptotické a anti‑apoptotické proteiny rodiny Bcl‑ 2 mohou tvořit dimery pomocí BH‑ 3 domény, a tím se navzájem inaktivovat [17,18]. Vzájemný poměr a interakce pro‑ a anti‑apoptotických členů rodiny Bcl‑ 2 tedy rozhoduje o tom, zda bude apoptotická dráha inhibována či posilována. Cytochrom c, uvolněný z mezimembránového prostoru mitochondrií, se v cytoplazmě spojuje s proteinem Apaf‑ 1 a prokaspázou‑ 9 a v tomto komplexu zvaném apoptozom je prokaspáza‑ 9 štěpena na aktivní kaspázu‑ 9 [19,20]. Z mitochondrií jsou dále uvolňovány proteiny SMAC/ DIABLO, ARTS či proteáza Omi/ HtrA2, které vážou a inaktivují anti‑apoptotické proteiny IAPs přítomné v cytoplazmě (inhibitor of apoptosis; NAIP, c‑ IAP1/ HIAP‑ 2, c‑ IAP2/ HIAP‑ 1, XIAP/ hILP, Survivin and BRUCE ) [21– 23]. Proteiny AIF (apoptosis‑ inducing factor) a endonukleáza G, rovněž uvolňované z mitochondrií, mohou realizovat program buněčné smrti i v nepřítomnosti kaspáz [24]. Další organela, která může zasahovat do regulace apoptotické signální dráhy, je endoplazmatické retikulum, jež jako odpověď na stres aktivuje prokaspázu‑ 12 [25]. Rovněž lyzozomy se mohou účastnit regulace PCD, protože ně­kte­ré stimuly buněčné smrti vedou k částečné permeabilizaci lyzozomální membrány, uvolnění proteolytických enzymů do cytozolu a jejich aktivnímu přispění k aktivaci kaspáz [26,27].

Aktivované signální kaspázy‑ 8, - 9, - 10 a - 12 dále aktivují tzv. efektorové kaspázy zajišťující inaktivační či aktivační štěpení řady proteinů, jako jsou regulátory apoptózy, proteiny související s buněčnou adhezí, cytoskeletem, strukturou jádra, buněčným cyklem, opravou a syntézou DNA atd. [28], což nakonec vyústí v úspěšnou eliminaci buňky poškozené nebo z jiných důvodů určené k likvidaci.

Buněčná smrt spojená s autofagií

Autofagie je vysoce konzervativní mechanizmus pro degradaci větších objemů buněčného materiálu, včetně celých organel. Poprvé byla popsána Christianem de Duve, který zavedl pojem „autophagy“ jako výstižný popis schopnosti buňky strávit a znovu využít své vlastní části (z řečtiny „autos“ = sebe, „phagein“ = pojídat) [29]. Rozlišujeme makroautofagii, mikroautofagii a autofagii zprostředkovanou chaperony [30]. Při makroautofagii (dále jen „autofagie“) jsou organely, dlouho‑ žijící proteiny nebo agregáty uzavírány do dvoumembránových útvarů zvaných autofagozomy, které následně fúzují s lyzozomy, a jejich obsah je v nich lyzozomálními proteázami degradován [31]. Katabolické produkty jsou pak buňkou znovu recyklovány v bio­syntetických procesech, nebo dále degradovány a využity jako zdroj energie v případě, že buňka hladoví. Celý proces je regulován skupinou genů označovaných ATG (autophagy‑related genes) a je detailně popsán např. v přehledovém článku Rosenfeldta a Ryana [32].

Autofagie je především mechanizmus, který buňce umožňuje přežití stresových podmínek, jakými jsou nedostatek živin nebo indukce nekrotické smrti v rakovinných buňkách či při ischemicko‑reperfúzním poškození tkání [33]. Její role v nádorových buňkách je nejasná a zřejmě závisí na stadiu nádorového onemocnění. Zatímco v raných fázích autofagie spíše suprimuje vývoj nádoru, protože odstraňuje poškozené organely a proteiny s nesprávnou, potenciálně škodlivou konformací [34], v pozdějších stadiích naopak zřejmě pomáhá rakovinným buňkám vyrovnat se se stresovými podmínkami, jako je nedostatek živin či oxidativní stres [35]. Tzv. autofagická buněčná smrt je charakterizována výrazným nárůstem počtu autofagických vakuol v buňce, bez kondenzace jaderného chromatinu, ukončená její smrtí [36]. Ačkoliv je akumulace autofagických vakuol v cytoplazmě často pozorována u buněk umírajících po aplikaci chemoterapie nebo radioterapie, není zcela prokázáno, zda je autofagie v těchto případech příčinou smrti, anebo jen doprovodným jevem [2]. Přímý důkaz, že autofagie může skutečně vést ke smrti konkrétních buněk in vivo, byl zatím podán pouze při vývoji slinných žláz Drosophily, ve kterých zablokování genů nezbytných pro autofagii vedlo k inhibici vývojové degradace těchto buněk [37]. I pokud by ale autofagie nebyla přímý vykonavatel buněčné smrti, vzhledem k časté detekci autofagických vakuol v umírajících buňkách zřejmě hraje v tomto procesu důležitou roli, a proto je i nadále nadějným cílem pro vývoj nových léčiv.

Nekroptóza

Za pasivní formu buněčné smrti byla vždy považována nekróza. Ta je charakterizována rychlou a neregulovanou ztrátou integrity plazmatické membrány a buněčným kolapsem, ačkoliv integrita jádra zůstává poměrně dlouho zachována. V posledních letech se však objevily studie prokazující, že alespoň část buněk s nekrotickou morfologií umírá regulovaným procesem zvaným programovaná nekróza nebo také nekroptóza [38]. Nekrotická smrt je pro buňku nejen záložní postup v případech, kdy je apoptóza z nějakého důvodu zablokována, ale má i svůj fyziologický význam např. jako obranný mechanizmus při virových infekcích. Z hlediska vlivu na nádorové buňky je nekrotická buněčná smrt dvousečnou zbraní. Nekróza vznikající jakožto důsledek chemoterapie přispívá k usmrcování nádorových buněk s defekty v apoptotické dráze. Na druhou stranu lokální zánětlivé procesy způsobené vyplavením obsahu nekrotických buněk např. z hypoxických oblastí nádoru spíše podporují angiogenezi a proliferaci nádorových buněk.

Nekroptózu můžou v buňkách aktivovat různé stimuly: IFNγ, nedostatek ATP, přítomnost patogenů, ischemicko‑reperfúzní poškození tkání, dvouřetězcová RNA (dsRNA) a vazba tzv. ligandů smrti (TNFα, TRAIL, FasL) na příslušný receptor [39]. Za normálních okolností tato vazba receptoru a ligandu vede k sestavení proteinového komplexu obsahujícího kaspázu‑ 8, adaptorový protein FADD a kinázu RIP1 (receptor‑ interacting serine‑ threonine kinase 1) a následně ke spuštění apoptózy prostřednictvím signální kaskády zahrnující aktivovanou kaspázu‑ 8 [40]. Jestliže jsou však kaspázy z nějakého důvodu inaktivní, je do tohoto proteinového komplexu zahrnuta i kináza RIP3. Kinázy RIP1 a RIP3 vzájemně interagují pomocí RIP‑ homotypické interakční domény. K této interakci dochází pouze v případě aktivace nekroptotické signální dráhy, jež může být blokována specifickým inhibitorem RIP1- kinázové aktivity –  nekrostatinem [41]. Protein RIP1 je spíše znám svou účastí při aktivaci proteinu NF‑ κB [42], a je tedy zřejmě důležitý účastník rozhodování, zda buňka přežije díky aktivaci NF‑ κB nebo zda bude eliminována apoptotickým, resp. nekroptotickým mechanizmem. Síť proteinů zasahujících do regulace programované nekrózy se díky novým poznatkům stále rozrůstá a zahrnuje dále např. PARP1, PAR polymery, NADPH oxidázy a kalpainy [43].

Pro‑nekrotický komplex RIP1– RIP3 následně interaguje s metabolickými enzymy a zvyšuje uhlovodíkový a glutaminový metabolizmus, což je doprovázeno zvýšením množství reaktivních kyslíkových radikálů (reactive oxygen species –  ROS) [44]. Právě ROS se zřejmě u většiny buněčných typů významně podílí na exekuční fázi nekrotického usmrcení buňky [45]. Biochemických změn probíhajících v nekrotické buňce je ale celá řada a většina z nich je fatální. Proto zatím nelze přesně říci, které z nich jsou pro osud buňky nejvíce zásadní a určující [46].

Mutace regulátorů programované buněčné smrti v nádorových buňkách

Úspěch chemoterapeutické léčby, která je často zacílena na DNA, je z podstatné části ovlivněn schopností buněk opravovat poškozenou DNA a také aktivovat eliminační apoptotický proces. V nádorových buňkách je mutována celá řada proteinů, jež přímo či nepřímo ovlivňují rezistenci buněk k indukci buněčné smrti. Pro jejich podrobný popis však není v tomto přehledovém článku dost prostoru. Jsou to např. proteiny p53, Ras, Raf, Src, NF‑ κB, HSPs a mnoho dalších.

V nádorových buňkách byly detekovány mutace proteinů, které jsou přímou součástí jak vnější apoptotické signální dráhy (vzácněji), tak vnitřní signální kaskády od mitochondriálních regulátorů po kaspázy. Jejich detailnějšímu popisu se budeme dále věnovat.

Receptory smrti

Buněčná smrt indukovaná Fas receptorem může být inhibována tvorbou rozpustného Fas, nedostatečnou expresí Fas na povrchu buňky, nadměrnou expresí inhibičních proteinů (Fas‑associated phosphatase‑ 1 nebo FLIP) či mutací v primární struktuře Fas [47– 49]. Mutace ve Fas receptoru byly poprvé popsány u mnohočetného myelomu [50] a jsou detekovány v různých typech lymfomů [51].

TRAILem indukovaná apoptóza může být blokována expresí tzv. decoy receptorů pro TRAIL, nadměrnou expresí inhibičních proteinů (FLIP) nebo mutací v primární struktuře DR4 a DR5 [52]. Mutace TRAIL‑R1 a TRAIL‑R2 receptorů byly detekovány např. u metastáz prsních karcinomů, nemalobuněčných prsních karcinomů či nádorů hlavy a krku [53– 55].

Rodina Bcl‑ 2

Bcl‑ 2 protein byl původně objeven v buňkách B‑lymfomu, v nichž je v důsledku chromozomální translokace t(14;18) jeho gen fúzován se silným promotorem imunoglobulinu. Díky tomu je jeho hladina výrazně zvýšena [56]. Zvýšená hladina Bcl‑ 2 byla pozorována i v solidních nádorech, jako jsou nádory plic, prsu a mozku. Důvodem zvýšené transkripce jsou pravděpodobně hypometylace promotoru či ztráta příslušných miRNA, které negativně regulují expresi bcl‑ 2 [57].

Vysoká hladina exprese proteinu Bcl‑ XL byla zjištěna v buňkách mnohočetných myelomů a lymfomů [58]. Zvýšený počet kopií genů bcl‑ xL a mcl‑ 1 byl dále detekován v řadě jiných nádorů, např. plic a kostí [59].

Také pro‑apoptotické proteiny rodiny Bcl‑ 2 mohou zastávat funkci nádorových supresorů. Jejich snížené hladiny v důsledku mutací (Bim, Puma) či epigenetických modifikací (Puma) byly totiž popsány u B‑lymfomů nebo Burkittova lymfomu [59– 61]. Mutovaný Bax byl zachycen např. u nádorů gastrointestinálního traktu a v leukemiích [62,63].

Apaf‑ 1

Snížená hladina Apaf‑ 1, detekovaná v metastatických melanomech, je spíše důsledek epigenetického umlčení exprese apaf‑ 1 než mutace v jeho kódující sekvenci [64]. Snížená hladina Apaf‑ 1 je znak špatné prognózy u pacientů s B typem chronické lymfocytické leukemie, pokud se vyskytuje současně s mutací v proteinu p53 [65].

IAPs

Chromozomální region 11q21– 22, kódující cIAP1 a cIAP2, je amplifikován v mnoha typech nádorových tkání –  hepatocelulárním karcinomu, karcinomu prsu, meduloblastomu, a v karcinomech slinivky, plic, děložního hrdla či jícnu [66]. Asi u 30 % MALT lymfomů je detekována chromozomální translokace t(11;18) (q21;q21), díky které vzniká chimérický protein N‑terminální sekvence cIAP2 spojené s C‑terminální sekvencí MALT1 [67]. V lymfocytech mohou IAP proteiny zřejmě naopak působit protinádorově. Mutace v jejich kódujících sekvencích byly totiž zachyceny v mnohočetných myelomech [68] nebo lymfoproliferativních onemocněních [69].

Kaspázy

Z prozatím testovaných typů nádorových onemocnění byly mutace kaspázy‑ 8 (v kódující sekvenci, intronech a 3‘ nepřekládané oblasti) nejčastěji zachyceny v pokročilých stadiích nádorů žaludku [70]. Snížená exprese v důsledku hypermetylace promotoru byla popsána u relabujících glioblastomů, což naznačuje, že kaspáza‑ 8 může mít vliv na vývoj tohoto typu nádorů [71]. Inaktivační mutace kaspáz‑ 3 a - 7 byly pouze sporadicky zachyceny u solidních nádorů různých typů [72,73]. Polymorfizmus v regionu regulace transkripce kaspázy‑ 3 byl popsán v buňkách karcinomu skvamózních buněk hlavy a krku [74]. V myších se zablokovanou tvorbou kaspáz nebyla detekována zvýšená incidence nádorových onemocnění. Tyto výsledky tedy nasvědčují spíše tomu, že mutace jednotlivých kaspáz nepatří mezi hlavní příčiny neoplastické transformace buněk [75].

Přehled testovaných léčiv založených na reaktivaci programované buněčné smrti

Při onkologické terapii jsou nejčastějším cílem léčiv proliferativní mechanizmy a onkogenní signály podporující přežívání nádorových buněk. Vývoj novějších léků je mimo jiné zaměřen na reaktivaci apoptotických signálních drah, a to jak vnější, tak především vnitřní, jež by mohly vést k úspěšné regresi nádoru. Hlavní cílové molekuly vytipované pro léčbu, princip účinku preparátu a fáze klinických zkoušek, ve kterých jsou nejnadějnější preparáty testovány, jsou shrnuty v tab. 1.

Závěr

Nádorová onemocnění jsou dlouhodobě druhou nejčastější příčinou úmrtí v ČR po nemocech srdce a cév. I přes narůstající incidenci se u nás daří stabilizovat mortalitu díky časnějšímu záchytu onemocnění a také díky novým léčebným metodám. Poznatky základního výzkumu na molekulární a buněčné úrovni přináší nové možnosti přesného a efektivního zacílení léčby, mimo jiné i na proteiny apoptotické signální dráhy, jejíž reaktivace by mohla vést ke zlepšení odpovědi na protinádorovou terapii.

Práce byla podpořena grantem Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101) a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Eva Ondroušková, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: eva.ondrouskova@mou.cz

Obdrženo: 14. 1. 2014

Přijato: 6. 3. 2014