Využití průtokové cytometrie pro analýzu mitochondriální buněčné smrti

Súhrn

Apoptóza je typ programované buněčné smrti (typ I), který je nezbytný pro správný vývoj organizmu a tkáňovou homeostázu. Její průběh může být určen dvěma signálními drahami – vnější (receptorovou) dráhou řízenou receptory smrti a vnitřní (mitochondriální) apoptotickou dráhou, kde klíčovou roli plní mitochondrie. Mitochondrie jsou důležité buněčné organely s nepostradatelnými funkcemi pro život buňky, jako je např. tvorba energie ve formě molekul ATP (adenosintrifosfátu). Mitochondriální buněčná smrt je charakteristická změnou transmembránového potenciálu a permeabilizací vnější mitochondriální membrány. Mitochondrie jsou elektronegativní organely a depolarizace mitochondriální membrány je důležitá pro uvolnění proapoptotických signálů. Narušená regulace mitochondriální buněčné smrti se může podílet na patogenezi různých onemocnění, včetně rakoviny. Mitochondrie jsou také zdrojem reaktivních kyslíkových radikálů, iontů Ca²⁺ a proteinů ovlivňujících procesy iniciace a progrese nádorů nezávisle na indukci apoptózy. Současné studie se zaměřují na výzkum mitochondriálního membránového potenciálu a kyslíkových radikálů, které modulují různé signální dráhy uvnitř buňky a vymezení jejich významu v kancerogenezi, případně v léčbě onkologických pacientů. Monitorování apoptotických markerů, jako je stav mitochondriálního membránového potenciálu a určení hladiny reaktivních kyslíkových radikálů ve vzorcích nádorových pacientů, má prediktivní hodnotu pro výstup léčebných protokolů.

Klíčová slova:
mitochondrie –  průtoková cytometrie –  apoptóza –  volné radikály –  membránový potenciál mitochondrií

Úvod

Nádorová onemocnění patří po kardiovaskulárních chorobách k druhé nejčastější příčině úmrtí ve vyspělých zemích. V počtu onkologických pacientů za­ujímá Česká republika přední místa v Evropě. Každý rok onemocní nádory v ČR přes 77 000 lidí (data za rok 2010). Statistika ukazuje, že v průběhu života každý třetí obyvatel v ČR onemocní rakovinou a každý čtvrtý na ni zemře [1,2].

Existuje mnoho typů rakoviny, ale nelze říci, že existuje jedna všeobecně použitelná léčba. Společné jsou ovšem principy léčby. Mezi nejčastější protinádorovou léčbu se řadí chirurgický zákrok, radioterapie a chemoterapie. Chemoterapie je léčba založená na podávání cytostatických látek, které jsou toxické pro rychle se dělící buňky. Zdravá buňka zasažena cy-tostatikem má na rozdíl od nádorové buňky díky svým nepoškozeným opravným mechanizmům větší šanci na přežití. Ně­kte­ré typy nádorů nejsou ovšem k působení cytostatických látek z různých důvodů citlivé. Proto je důležité objasnit příčinu chemorezistence nádorových buněk, zaměřit se na správné signální dráhy a tím otevřít nové možnosti léčby rakoviny. Jednou z takových možností, které se mnohé studie věnují s cílem zvýšit protinádorovou aktivitu a selektivitu chemoterapeutických látek a překonat lékovou rezistenci nádorů, je kombinace tradiční chemoterapie s látkami zaměřenými na ovlivnění funkce mitochondrií [3]. Výzkum se zaměřuje na roli mitochondrií a mitochondriálního membránového potenciálu v buněčném přežívání/ smrti. Ovlivněním mitochondrií dochází k permeabilizaci mitochondriální membrány s následným uvolněním superoxidových aniontů a molekul peroxidu vodíku a k indukci buněčné smrti u nádorových buněk rezistentních ke konvenční chemoterapii [4,5]. Studium souvislosti mezi účinností léčby a indukcí mitochondriální buněčné smrti je možné analýzou mitochondriálního membránového potenciálu a hladiny kyslíkových radikálů metodou průtokové cytometrie, která je rutinně využívána v dia­gnostice mnoha nemocí, ve výzkumu i klinické praxi. Význam průtokové cytometrie spočívá v tom, že umožňuje rychlou analýzu fyzikálních a bio­chemických parametrů tisíců buněk během několika sekund. Analýza mitochondriálního membránového potenciálu a reaktivních kyslíkových radikálů (reactive oxygen species – ROS) může přispět k prohloubení vědomostí o mechanizmech mitochondriální buněčné smrti a zlepšit strategie léčebných postupů u pacientů s nádorovým onemocněním.

Buněčná smrt

Buněčná smrt je fyziologický proces důležitý pro vývoj organizmu, udržuje tkáňovou homeostázu kontrolou počtu buněk a defenzivní strategií odstraňuje buňky infikované, mutované nebo poškozené. V lidském těle jsou každou vteřinu mitózou produkovány nové buňky v řádu stovek tisíců a podobný počet buněk umírá fyziologickým procesem zvaným apoptóza [6,7]. Apoptóza je evolučně konzervativní u mnohobuněčných organizmů a je striktně regulována genetickým programem. Může být iniciována nebo inhibována širokým spektrem environmentálních stimulů –  fyziologických i patologických. Odehrává se ve dvou fázích. První je charakteristická tvorbou apoptotických tělísek. Druhá je jejich fagocytóza a degradace jinými buňkami [8]. Apoptotický proces vede k sérii charakteristických morfologických a bio­chemických změn. Genetickým programem dochází k aktivaci cysteinových aspartyl‑ proteáz –  tzv. kaspáz, které hrají v apoptóze zásadní roli. Kaspázy jsou syntetizovány jako neaktivní polypeptidy (zymogeny), jež jsou proteolyticky štěpeny jinými proteázami a sestavovány do aktivních tetramerů. Kaspázy štěpí mnoho rozmanitých jaderných a cytoplazmatických substrátů, které vedou k rozkladu buňky [9,10]. Mezi charakteristické morfologické změny apoptotické buňky patří kondenzace chromatinu, fragmentace DNA, smrštění plazmatické membrány spojené s translokací fosfatidylserinu na vnější stranu plazmatické membrány a tvorba apoptotických tělísek následně fagocytovaných makrofágy [8,11,12]. Další skupinou proteinů významných pro apoptotickou signalizaci jsou proteiny rodiny Bcl2, jejíž zástupci apoptózu inhibují nebo podporují. Antiapoptotické proteiny, např. Bcl2 a Bclxl, apoptózu iniciovanou širokým spektrem signálů (např. růstovými faktory, cytokiny, chemoterapeutiky, poškozením DNA, UV zářením) inhibují, zatímco proapoptotické proteiny, např. Bax a Bak, ji stimulují [13– 15]. Mezi jiné bio­chemické události, které se účastní apoptotické signalizace, patří změny v mitochondriálním membránovém potenciálu, redistribuci a množství ROS, vápenatých iontů, množství cytochromu c,proapoptotických proteinů a inhibitorů antiapoptotických molekul v cytoplazmě. Deregulace apoptózy vede k imunodeficienci, nádorovým a autoimunitním onemocněním. Možnost modulace apoptotických procesů otevírá nové strategie léčebných postupů a zlepšení chemoterapie.

Mitochondrie a mitochondriální apoptotická dráha

Mitochondrie jsou tvořeny lipidovou dvojvrstvou –  vnější a vnitřní mitochondriální membránou, což je dáno jejich endosymbio­tickým původem [16]. Skládají se ze tří částí: mitochondriální matrix s DNA, mezimembránového prostoru a mitochondriálních krist. Kompartmentalizace mitochondrií je nezbytná pro správnou lokalizaci dějů, které se v nich odehrávají. Základní funkcí mitochondrií jako hlavních energetických organel je oxidativní fosforylace spojená s produkcí ATP (adenosintrifosfátu). Mitochondrie mají ale také klíčový význam v indukci buněčné smrti. Mitochondriální dráha apoptózy (neboli vnitřní apoptotická dráha) je aktivována hlavně nereceptorovými stimuly, zahrnujícími cytotoxický stres, endoplazmatickoretikulární (ER) stres, poškození DNA, cytokinovou deprivaci, nedostatek růstových faktorů, ale mohou ji aktivovat také receptory smrti (death receptors) (obr. 1). K iniciaci mitochondriální apoptotické dráhy dochází nejméně třemi možnými mechanizmy: 1. uvolněním proapoptotických proteinů iniciujících kaspázovou aktivitu; 2. poškozením elektronového transportu, oxidativní fosforylace a produkce ATP, která může vést k energetické katastrofě; 3. změnou redoxního potenciálu s následkem zvýšení buněčného oxidativního stresu [17]. Následkem iniciace vnitřní apoptotické dráhy dochází k inkorporaci proteinů Bax a Bak z cytosolu do vnější mitochondriální membrány. Aktivovaný protein Bax je translokován do vnější mitochondriální membrány z cytosolu buňky, zatímco aktivovaný protein Bak je již začleněn do vnější mitochondriální membrány, kde se váže na proteiny Mcl1 a Bclxl [18– 21]. Inkorporace proteinů Bax a Bak do mitochondriální membrány má směrodatný následek –  permeabilizaci mitochondriální membrány. Mitochondrie jsou charakteristické membránovým potenciálem okolo 150 mV a mitochondriálním gradientem pH. Tyto bio­chemické parametry mitochondrií se účastní vzniku protonového elektrochemického gradientového potenciálu na vnitřní mitochondriální membráně. Tento primární bio­energetický parametr přes redukci elektronů prostřednictvím respiračního elektronového transportního řetězce (electron transport chain –  ETC) kontroluje produkci mitochondriálního ATP. Narušení membránového potenciálu vede k permeabilizaci mitochondriální membrány s následným uvolněním proapoptotických faktorů, jako jsou cytochrom c, SMAC, DIABLO, z intermembránového mitochondriálního prostoru do cytosolu. Tyto události vedou k sestavení apoptotického proteinového komplexu zvaného apoptozóm tvořeného prokaspázou 9, proteinem Apaf‑ 1 a cytochromem c, s následnou aktivací kaspázy 3 a dalších exekučních kaspáz. Mimo to protein Bax může také indukovat apoptózu přes mitochondriální poškození i v případě neaktivních kaspáz [22]. Buněčná signalizace indukující apoptózu vede k dalším mitochondriálním změnám, jako otevření permeabilních tranzitních pórů (PT pórů), které je vysoce regulováno iontovými kanály lokalizovanými v kontaktním místě vnitřní a vnější mitochondriální membrány [23]. PT póry jsou velké proteinové komplexy, primárně určené k transportu adeninových nukleotidů, cyklofilinu D a k regulaci aniontových kanálů závislých na napětí (VDAC, poriny), které mohou interagovat s dalšími proteiny [23,24]. Otevření PT pórů umožňuje průchod látek o velikosti až 1 500 Da a vede k depolarizaci mitochondrií. Otevření PT pórů také zvyšuje propustnost molekul vody přes mitochondriální membránu s následným zvyšováním koncentrace vody v mitochondriální matrix a bobtnáním mitochondrií [25,26]. Depolarizace mitochondriální membrány vede k inhibici respirace, tvorbě reaktivních kyslíkových radikálů a ztrátě produkce ATP [23,27].

Princip průtokové cytometrie

Průtoková cytometrie je metoda, která umožňuje simultánní měření a analýzu fyzikálních a chemických vlastností buněk nebo jiných bio­logických částic během jejich průchodu laserovým paprskem. Ve chvíli, kdy buňka prochází paprskem, dojde k rozptylu a lomu světla, jenž je podle směru a úhlu lomu označován jako přímý rozptyl (forward scat­ter –  FSC) a boční rozptyl (side scatter –  SSC). FSC je charakterizován lomem světla o malém úhlu (2– 13°) a je úměrný velikosti buňky, úhel SSC je 90° a charakterizuje vnitřní buněčné struktury, např. granularitu buňky. Dále je průtokovým cytometrem detekována fluorescence procházejících mikroskopických částic. Na analyzované buňky nebo jejich části se váží fluorescenční barviva (fluorochromy), která absorbují světlo určité vlnové délky vyzařované laserem a následně vyzařují (emitují) část takto absorbovaného světla o odlišné vlnové délce.

Průtokový cytometr se skládá z fluidního, optického a elektronického systému (obr. 2). Pomocí fluidního systému jsou buňky nasávány pod tlakem do průtokové komory s nosnou kapalinou, kde dochází k jejich separaci a kde paprsek monochromatického laseru prochází buňkou. Optický systém sestává z excitační části, tvořené laserem a soustavou čoček a hranolů usměrňujících paprsek, a z části sběrné, která se skládá z optických zrcadel a filtrů umožňujících detekci světelných kvant specifické vlnové délky příslušnými optickými detektory. K převodu optického signálu na elektrický a k digitalizaci pro počítačovou analýzu slouží elektronický systém. Analyzovaná data mohou být zobrazena jako tzv. dot plot, dvourozměrný graf, kde každá tečka reprezentuje jednu buňku, nebo ve formě histogramu pro jednoparametrovou analýzu. Výhodná je multiparametrová analýza umožňující výběr různých buněčných populací s různými vlastnostmi a jejich vzájemnou kombinaci. Průtokové cytometry jsou běžně vybaveny 2– 3 detektory, které měří světlo specifické vlnové délky emitované buňkou. Nejčastějšími fluo­rochromy se společnou excitační vlnovou délkou 488 nm (dosaženou argonovým modrým laserem) jsou fluorescein izothiokyanát (FITC), phycoerytrin (PE), peridin‑chlorofyl (PerCP), phycoerytrin‑Cy5 (PE‑ Cy5), Texas red aj. Fluorochromy mohou být konjugovány s různými protilátkami, a být tak využity pro vícebarevné analýzy. Speciální aplikací průtokové cytometrie je buněčné třídění (cell sorting), kdy jsou buňky tříděny do sběrných zkumavek na základě předem známých parametrů.

Detekce permeabilizace mitochondriální membrány

Více než půl století je známo, že ně­kte­rá barviva v určitém prostředí agregují. Tvorba agregátu je doprovázena dramatickým posunem v absorpčních i fluorescenčních maximech barviva. Unikátní znak těchto barviv je užitečný při bio­logických studiích vlastností buněk a charakteristik buněčných struktur. Značná velikost molekul fluorescenčního barviva umožňuje jejich pomalou absorpci do sledovaných struktur, a jsou proto užitečné jako reportérové molekuly pro lokalizaci bio­chemických událostí [28]. Tyto molekulární sondy jsou schopny detegovat změny mitochondriálního membránového potenciálu průtokovou cytometrií. Mnoho z těchto sond je klasifikováno do třídy lipofilních kationtů. Sondy se akumulují v mitochondriální matrix, což je dáno negativním nábojem mitochondrií. Safranin [29,30], tetrafenylfosfonium (TPP) [31] a rhodamin 123 [32] jsou členy této třídy. Nicméně jejich nevýhodou je absence možnosti kvantifikace. TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) a TMRE (tetramethylrhodamine ethyl ester) jsou fluorescenční deriváty rhodaminu 123, které mohou být užity ke kvantifikaci pomocí fluorescence [33,34], tak jako DiOC₆ (3,3’- dihexyloxacarbocyanine iodide). DiOC₆ je jednou z nejčastěji používaných sond pro měření membránového potenciálu průtokovou cytometrií. Nevýhodou DiOC₆ je ovšem její vysoká toxicita zasahující respirační řetězec a při použití ultra‑ nízkých koncentrací vyžaduje přesné měření, což omezuje její využitelnost v porovnání s ostatními sondami. Sonda JC‑ 1 (5,5’,6,6’- tetrachloro‑1,1’,3,3’- tetraethylbenzimidazolcarbocyanin iodid) je považována za nejvýkonnější sondu pro detekci změn mitochondriálního membránového potenciálu. Molekuly sondy JC‑ 1 existují v monomerní formě a emitují fluo­rescenci o vlnové délce 527 nm po excitaci světlem o vlnové délce 488 nm. V závislosti na membránovém potenciálu je sonda schopna vytvářet J‑ agregáty (čím větší polarizace membrány, tím větší akumulace sondy) spojené s emisí světla o vlnové délce 590 nm [35]. Při depolarizaci mitochondriální membrány dochází k následnému uvolňování sondy do cytosolu, které se projeví poklesem intenzity fluorescence.

Volné radikály

Současné výzkumy se ve zvýšené míře zaměřují na volné radikály a jejich roli v nádorovém mikroprostředí. Volné radikály jsou molekuly s vysokou mírou nestability, která je vyvolána přítomností jednoho či více elektronů ve vnějším orbitu jejich atomů. Jejich vysoká reaktivita způsobuje vytrhávání elektronů ze sousedních atomů a následkem toho dochází k poškození funkce dané molekuly. Různé vnitřní a vnější okolnosti a/ nebo bio­chemická aktivita mohou narušit kontrolu nad udržením rovnováhy mezi vznikem volných radikálů a jejich degradací. Antioxidanty jsou hlavním zdrojem ochrany těla proti volným radikálům. Antioxidanty transformují volné radikály do méně reaktivních a pro organizmus méně škodlivých forem. Příkladem těchto antioxidantů jsou CAT (kataláza), SOD (superoxid dismutáza), GPx (glutation peroxidáza) [36,37]. Nerovnováha mezi hladinou volných radikálů a jejich degradací antioxidanty se nazývá oxidativní stres a může zapříčinit poškození vedoucí k různým onemocněním [38]. Mezi volné radikály se řadí radikály kyslíku a dusíku, které jsou klíčovými regulátory v iniciaci a progresi nádorů. Radikály způsobují poškození genomu, zvyšují genetickou nestabilitu a zprostředkovávají modulaci různých procesů spojených s patogenezí nádorů, jako jsou apoptóza, angiogeneze, buněčný cyklus, invazivita, metastazování, metabolizmus [39]. Různé reaktivní formy kyslíku jsou označovány jako ROS (reactive oxygen species) [40,41] a zahrnují superoxidové anionty (O₂– •), které jsou formovány NADPH oxidázami a jsou produkovány především v mitochondriích. Účinkem SOD (superoxid dis­mutázy) následně dochází k formování molekul peroxidu vodíku [41]. Další redukční procesy transformující peroxid vodíku cestou Fentonovy reakce do hydroxylových radikálů (•OH) a poté do konečného produktu, kterým je voda, je zprostředkován účinkem katalázy (CAT) a glutation peroxidázy [41]. Když molekuly kyslíku vážou protony jiných volných radikálů, vznikají hydroperoxidové radikály (HO₂– •) [42]. Mezi reaktivní formy dusíku označované RNS (reactive nitrogen species) patří volné radikály oxidu dusnatého (NO•), peroxydusitany (ONOO– ), radikály oxidu dusného (NO₂•) a dusitany (NO₂– ) [43]. NO• vzniká prostřednictvím proteinové rodiny NOS (nitric oxide synthetase). ONOO–  vzniká reakcí NO• s molekulou O₂– •, s NO₂• jako meziproduktem. Tento meziprodukt reaguje s NO• a tím vytváří N₂O₃ (dinitrogen‑ trioxid) [42]. NOS zahrnují různé izoformy: neurální (nNOS nebo NOSI), inducibilní (iNOS nebo NOSII), endoteliální (eNOS nebo NOSIII) a mitochondriální (mtNOS), všechny závislé na aktivitě NADPH a kalmodulinu [44]. Buněčné metabolické systémy neustále produkují volné radikály z kyslíku. Kolem 80 % molekul kyslíku je spotřebováno v mitochondriích a asi 5 % z nich je transformováno do superoxidových aniontů a hydroxylových radikálů. Endogenní (prostaglandiny, mastné kyseliny) a exogenní látky (léčiva, barviva, antioxidanty) jsou metabolizovány v hladkém endoplazmatickém retikulu, spotřebovávají 15 % molekul kyslíku, z nichž kolem 2– 30 % je určeno k transformaci do volných radikálů, hlavně do hydroxylových radikálů. Makrofágy a leukocyty tvoří radikály jako obranný mechanizmus proti bakteriím a virům. Volné radikály jsou užity v syntéze prostaglandinů, cholesterolu a steroidních hormonů. Hydroxylace lysinu a prolinu do hydroxylysinu a hydroxyprolinu je nutná pro bio­syntézu kolagenu, což vyžaduje účast hydroxylových volných radikálů [45]. Volné radikály mají význam během metabolických a obranných dějů zdravých buněk. Jejich přítomnost v buňce je ovšem spojena s rizikem hlavně pro přítomné velké molekuly, jako jsou nukleové kyseliny, proteiny, polysacharidy, lipidy, které mohou být poškozeny oxidací volnými radikály [45].

mtROS

Tvorba mitochondriálních ROS (mtROS) se odehrává v místě transportního elektronového řetězce (electron transport chain –  ETC) v místě vnitřní mitochondriální membrány během procesu oxidativní fosforylace. Oxidativní fosforylace je důležitý buněčný proces, který využívá kyslíku a jednoduchých cukrů k vytvoření ATP, hlavního zdroje energie pro buňky. Součástí tohoto procesu je pět velkých proteinových komplexů, zvaných komplex I– V. Jednotlivé fáze ETC neprobíhají dokonale. Uvolnění elektronů z komplexu I a III vede k částečné redukci kyslíku na superoxidovou formu. Superoxidový aniont je rychle dismutován na peroxid vodíku dvěma dismutázami –  superoxid dismutáza 2 v mitochondriální matrix a superoxid dismutáza 1 v mitochondriálním intermembránovém prostoru. Superoxidové anionty a peroxidy vodíku tvořené v tomto procesu jsou považovány za mitochondriální ROS. Superoxidové anionty mají elektrofilní vlastnosti a krátký poločas rozpadu. Mohou prostupovat přes vnější mitochondriální membránu a ovlivňovat signální cesty v cytosolu buňky [46]. Superoxidové anionty mohou navíc podléhat reakci s jinými radikály, jakými jsou oxidy dusíku (NO), a vytvářet peroxidusitany (ONOO2•– ) uvnitř mitochondrií a indukovat poškození DNA, narušení mitochondriální integrity a nevratné modifikace proteinů. Na rozdíl od superoxidových aniontů je peroxid vodíku nukleofilní a více stabilní. Navíc jeho koncentrace je stonásobně vyšší než u superoxidových aniontů [47]. Teoreticky by produkce mtROS měla být přímo úměrná s množstvím mitochondrií v buňce. Bylo dokázáno, že faktor mitochondriální bio­geneze PGC1α (factor peroxisome proliferator‑activated receptor‑γ coactivator 1α) zvyšuje nejen mitochondriální hmotnost, ale také expresi mnoha antioxidantů zahrnujících SOD2 GPx [48]. Mitochondriální hmotnost tedy není důležitý faktor, který reguluje tvorbu mtROS. Mitochondrie jsou dynamické organely, jež často mění svůj počet, velikost, tvar a distribuci v odpovědi na intra‑  a extracelulární stimuly. Mitochondrie mohou podléhat selektivní autofagické degradaci zvané mitofagie [49]. Narušení těchto procesů je spojováno s neurodegenerativními onemocněními [50]. Procesy mitochondriálního dělení a fúze jsou důležité pro redistribuci jejich proteinů a ochraně proti škodlivým účinkům mutací mtDNA. Tyto procesy jsou regulovány proteiny N‑ ethylmaleimide‑ sensitive factor attach­ment protein receptor (SNARE)‑like, které zahrnují mitofusin‑1 a - 2. Přesná regulace těchto procesů není popsána, ačkoli je doloženo, že mtROS zvyšují mitochondriální fragmentaci [51]. Zdravé, diferencované buňky spoléhají v produkci ATP na mitochondriální respiraci (aerobní fosforylaci) v přítomnosti kyslíku (tvorba 36 mol. ATP/ mol. glukózy). Za podmínek limitního množství kyslíku spoléhají buňky na anaerobní glykolýzu jako zdroj energie (tvorba 2 mol. ATP/ mol. glukózy). Většina nádorových buněk se adaptuje na aerobní glykolýzu jako způsob produkce energie [52]. Tento fenomén je známý jako Warburgův efekt [53]. Ukázalo se, že nádorové buňky mají další energetické požadavky přesahující možnosti aerobní fosforylace, což zvyšuje oxidativní stres [54]. V rychle proliferujících nádorových buňkách podporuje přítomnost onkogenních mutací aberantní metabolizmus a proteosyntézu s následkem zvýšené produkce ROS. Bylo zjištěno, že Warburgův efekt poskytuje výhodu transformovaným buňkám posílením antioxidačního systému k neutralizaci akumulace ROS. Jeden z klíčových glykolytických enzymů –  pyruvát‑ kináza –  hraje důležitou roli v tomto procesu, nádorové buňky exprimují přednostně M2 izoformu tohoto enzymu (PKM2) [55] a akutní zvýšení intracelulární hladiny ROS může inhibovat PKM2 oxidací cysteinových zbytků tohoto enzymu [56]. Inhibice PKM2 pak vede k produkci dostatečného redukčního potenciálu, který způsobuje detoxifikaci ROS odklonem glukózového metabolizmu do pentózafosfátového cyklu. Tím, že nádorová buňka reguluje vlastnosti PKM2, poskytuje ochranu proti nadměrné produkci ROS běžně pozorované v nádorech [57].

Detekce mtROS

Přítomnost intracelulárních mtROS může být detegována fluorescenčními barvivy. Mezi nejčastěji používaná patří dichlorodihydrofluorescein (DCF) a dihydroethidium (DHE). Nevýhodou běžně užívaného fluorescenčního indikátoru ROS dichlordihydrofluoresceinu je jeho nespecifičnost (je senzitivní k více typům ROS), nemůže být cílený do specifických intracelulárních kompartmentů a může při expozici světlem produkovat ROS, které mají za následek tvorbu artefaktů amplifikací signálu. DHE je fluorescenční indikátor superoxidových aniontů. Ve spojení s markery specifickými pro mitochondrie, jako je MitoTracker užívaný pro konfokální mikroskopii, můžeme určovat, zdali jsou ROS generovány z mitochondrií [58,59]. HyPer plazmidy jsou první geneticky kódované fluorescenční senzory schopné detegovat intracelulární peroxidy vodíku. Plazmid je vytvořen vložením cDNA kódující žlutý fluorescenční protein do regulační domény proteinu OxyR E. coli [60]. HyPer plazmid vykazuje submikromolární afinitu k molekulám peroxidu vodíku a současně je necitlivý k ostatním druhům ROS. Plazmidy HyPer nezpůsobují artefakty ROS a mohou být užity pro detekci rychlých změn v koncentracích peroxidu vodíku v různých buněčných kompartmentech. Pro minimalizaci signálů přicházejících z ostatních nemitochondriálních organel se k detekci mtROS využívají fluorescenční indikátory modifikované k zacílení přímo na mitochondrie. Jsou založeny na bázi lipofilních kationtů, které jsou přitahovány elektronegativním prostředím mitochondrií způsobeným protonovým gradientem na vnitřní mitochondriální membráně. MitoSOX je DHE spojený s trifenylfosfoniem (TPP+). Využívá prudkého elektrochemického gradientu na vnitřní mitochondriální membráně a hromadí se uvnitř mitochondrií (stonásobně více v porovnání s cytosolem). MitoSox je účinně užíván k přímé detekci mitochondriálních superoxidových aniontů v různých buněčných typech [61]. Přidání motivu TPP+ k fenylboronát esteru tvoří MitoPY1 [62], bio­logicky kompatibilní sondu pro detekci mitochondriálního peroxidu vodíku. Při zvýšení hladiny H2O2 dochází k významnému nárůstu fluo­rescence MitoPY1, kterou je možné detegovat konfokální mikroskopií i průtokovou cytometrií. Další sondy používané pro detekci mtROS jsou MitoAR, jež reaguje na •OH a HOCl•, a MitoHR, která je více senzitivní k •OH. Tyto sondy vznikly přidáním fluoroforu podobného rhodaminu k 4- amino‑ fenyl aryl etheru, nebo resp. k 4- hydroxy aryl ether skupině [63]. pHyPer‑ dMito je savčí expresní vektor obsahující sekvenci MTS (mitochondrial targeting sequence) odvozenou z podjednotky VIII lidské cytochrom c oxidázy, fúzované s HyPer (fluorescenční senzor peroxidu vodíku), který umožňuje detekci molekul peroxidu vodíku tvořených přímo v mitochondriích.

Závěr

Rakovina je velmi heterogenní onemocnění a různorodost mezi buněčnými populacemi nádorů může ovlivňovat jak jejich schopnost expanze a progrese, tak citlivost k protinádorové terapii. Mitochondriální buněčná smrt je důležitá součást života buněk a za patologických podmínek může dojít k narušení průběhu tohoto procesu. V důsledku změn v mitochondriální struktuře a funkci může vznikat chemorezistence nádorových buněk. Rozdíly membránového potenciálu mezi jednotlivými buňkami nádoru odráží buněčnou heterogenitu a prostřednictvím jeho analýzy mohou být identifikovány buňky, které jsou důležité v nádorové progresi. Membránový potenciál tak může být potenciální prediktor odpovědi na protinádorovou léčbu a/ nebo přímý cíl chemoterapie [63]. Studium mitochondriálního potenciálu a detekce ROS může přispět k lepšímu porozumění apoptotického mechanizmu a sestavení efektivnější léčby pro pacienty s nádorovým onemocněním.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101) a IntegRECAMO, CZ.1.07/2.3.00/20.0097).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc.

Ústav experimentální biologie

Přírodovědecká fakulta MU

Kotlářská 2

611 37 Brno

e-mail: smarda@sci.muni.cz

Obdrženo: 13. 1. 2014

Přijato: 11. 4. 2014